2ちゃんねる ★スマホ版★ ■掲示板に戻る■ 全部 1- 最新50  

■ このスレッドは過去ログ倉庫に格納されています

▼今実験でうまくいかないこと▼パート7▼

1 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/04(土) 18:18:41
いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

★過去スレ★
 いま実験でうまくいかないことスレッド
  http://cheese.2ch.net/life/kako/967/967541407.html
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
  http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
  http://science2.2ch.net/life/kako/1026/10263/1026312578.html
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート4▼
  http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1093050850/
 ▼今実験でうまくいかないこと▼パート5▼
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1121097197/
 ▼今実験で上手くいかない事を質問するスレ▼ part6
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1146716446/

☆主な関連スレ☆
 ◆生物学専門家への質問はここに書き込めPart22◆
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1162375329/
 ◆2ch高校生のための生物質問板 7時間目◆
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1161079191/
 質問に対して小学生でもわかる回答をするスレの3
  http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1145937037/
 タンパク質の精製3
  http://science3.2ch.net/test/read.cgi/life/1104733094/

2 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/05(日) 10:18:22
新調したばかりの靴に、E.coli零したorz

3 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/05(日) 12:26:36
オスバン部隊 出動!

4 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/05(日) 19:33:44
>>2

(・∀・)つ http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1048661187/l50
{実験}悲しいとき〜

5 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 00:03:25
どうも。前スレでRT-PCR生成物を発現ベクターにクローニングできずに困っていてここで
相談させて頂き、 pCR-Blunt II-TOPO を勧めていただいた者です。

お陰様でcDNAのTOPOクローニングはできたのですが、切り出して発現ベクターに入れると、
制限酵素2種類使っているのに、おかしな配列を伴って逆向きに入ったものだけが生き残り
ます(拾ったコロニーについて)。

培地には抗生物質の他に1%グルコースを入れています。
大腸菌はNovaBlueの他にHB101株を使ってみました。
プライマーも再合成したものを使っています(長さを短くしました)。

なにか他に策はありませんでしょうか。

形質転換の後、向きが分かるようなコロニーPCRでスクリーニングしまくれば数撃てば当たり
ますでしょうか。。

ちなみに目的蛋白質は、ほ乳類の分泌蛋白質で、シグナル配列を除去した領域に対応するcDNAに
制限酵素配列を付けて増幅し、pETベクターの大腸菌用のシグナル配列を付けようとしています。
また、分泌後、他の蛋白質と複合体を作って1つの機能を持ちます。相手方はペリプラスムに
安定して発現しています。

6 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 02:23:11
プラスミドに入れたDNAのシーケンスで、プラスミドの標準的な
プライマー(インサート配列を挟むフォワードとリバース)の片方
ではきれいに読めるのに、もう片方はぐちゃぐちゃで全く読めない
んですが、どんな原因が考えられますか?

7 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 08:47:24
漏れも同じ問題が…

8 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 08:59:37
>>6
プラスミドの濃度が最適値から外れている。

9 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 09:14:06
ナメクジのパッチクランプ

10 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 09:29:35
>>5
培養は全て30℃にする。

11 :5:2006/11/08(水) 11:20:47
>>10
ありがとうございます。
ライゲーション・形質転換後のSOC培養以降、全て30℃ですね。
やってみます。

30℃だと、SOC培地、LBプレート(+ Glc, Kan)の培養時間はどのくらい長くなるでしょう?

12 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 15:02:00
>>6 プライマーがアニールしそうな配列がインサートにある。
3' 9merが相同で読めない経験あり。

13 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 22:33:10
スレ違いだと思うがどうしても納得いかんので聞いて欲しい

「吸光度の単位はnm(ナノメートル)だよw」って自信満々のパートナーに見下す感じで言われた。
これ間違ってますよね?

14 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 23:10:14
無名数じゃね?

15 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 23:27:55
Arbitrary Unit

16 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/08(水) 23:49:59
>>13
そりゃ「そのサンプルがその吸光度を示した時の波長」だな。
吸光度は無次元数じゃろ?



・・・正直あまり自信ないです、ハイ。

17 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 01:00:59
培養に関しての疑問なんだけど、高密度培養による産生物収率の向上の原因って何?

18 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 03:34:20
nm = nautical mile (海里)

19 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 20:07:23
ABIの310でPOP6のままジーンスキャンやってるんだけどなかなかうまく行きません。
モジュールの設定とかどうすればいいか知ってる人いますか?

20 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 21:18:19
>>13
http://www.youtube.com/watch?v=0umpeN2uJbY

21 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/09(木) 21:54:11
吸光度:

光路長一定のとき、ある波長と等しいエネルギーを持った光子が
試料中に吸収される比率。単位は無次元([J/J])。

吸収された光子のエネルギーは、分子の振動や化学反応などに
利用された後、長波長の電磁波として放出されるため、
通常の吸光度計では検出できない。

22 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/10(金) 14:52:57
>12
サンクス。
調べてみたら、シーケンス用にメーカーが売ってるプライマーでも、
意外にアニールしそうな別の配列があるもんですね(しかもベクター部分!)。

23 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/13(月) 13:22:02
おまいら、ディスポのチャコールマスクって、どっち向きにはめてる?
漏れは黒い面が口の方になるように当ててるけど、先輩は「それだと口が黒くなる」
と言って白い面が口になるようにはめてます。
そうすると見た目がかなりかっこわるく見えるんだけど。。黒くなったこともないし。

24 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/13(月) 22:08:32
てゆーか
防塵マスクってひらべったくないだろ


25 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 01:13:10
>>23
http://www.hagitec.co.jp/hagiten/as/as8/as1303.htm#2
☆使用上の注意:装着する際は、黒い面を外側に白い面を顔側に装着してください。

26 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 04:41:54

20bp程度のオリゴを細胞内に導入する実験をしているのですが、エレクトロポレーションだと細胞が死んでしまったりして
うまくいきません。
できるだけ効率よく核内まで導入する方法って何でしょうか?


27 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 18:45:09
酵素のpH依存性を調べるために
酸性フォスファターゼでp-ニトロフェニルリン酸を加水分解したいんですが

実験書には、基質液に塩化マグネシウムを入れるように書いてあるのです。
これって入れる必要性が無いと思うのです・・・
皆様の御意見をお聞かせください

28 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 20:24:44
>>27
じゃあ入れなければ良いじゃん

29 :27:2006/11/14(火) 21:45:31
>>28
分かりました...orz
どうもすみませんでした

30 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/14(火) 23:27:13
>>27
なぜ、必要ないと思った?

31 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/15(水) 01:03:35
スレ違いだったらごめぬなさい。
ゼミで教授にEカドヘリン消失を介さない上皮間葉移行(epithelial to mesenchymal transition)は存在するのか調査を任命されました。
つまり、Eカドヘリンを発現していない上皮細胞は存在するのか?
EMT後にもEカドヘリンを発現している間葉系細胞はあるのか?
そんな報告があるのでしょうか?
自分では探しきれず、誰か詳しいヒト教えてくさい!!

32 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/15(水) 01:14:46
>>31
こんなところで人に頼っているのを教授が見たら泣くぞ

33 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/15(水) 08:17:50
ヲマイ、PCの前から離れるときはURL履歴を消しとけwwwww

34 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/16(木) 00:15:03
>>31
>ゼミで教授にEカドヘリン消失を介さない上皮間葉移行(epithelial to mesenchymal transition)は
>存在するのか調査を任命されました。

おまい、これでここで質問ってのはなしだわ・・・

35 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/16(木) 21:38:39
クローニングベクターに入った遺伝子を、制限酵素で切り出してゲル精製、
発現用のベクターに入れようとしています。

なぜか、とれたプラスミドはもとのサブクローンしたDNAのままでした。

何故なんでしょう??

36 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 00:47:10
制限酵素の切れ残りがコンタミしたんじゃねーの?
スーパーコイルの出てくる位置とインサートの位置は十分離れてるのか?
クローニングベクターと発現ベクターの耐性遺伝子は別?
カネあるならGatewayにするとつなぎかえの悩みはなくなる
マジおすすめ

37 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 01:48:14
俺だったらインサート切らずにベクターのみ切る酵素でさらに切ってみるだろうな

38 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 07:38:43
>>34
なんだ 知らないのか・・・ププwww

39 :31:2006/11/17(金) 10:37:10
>>32, 33, 34
そうすね
やっぱり自分で探してみまっす
厳しいお言葉産休

40 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 14:04:07
ここにはカメの専門家はいらっしゃいますか?

臨床家なのですが、今度ひょんなことから
ミドリガメをsacrifyして血液検査(PCR)をすることになりました。
ミドリガメからの採血の方法をご存知の方がいらっしゃいましたら
教えていただけないでしょうか。

41 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 14:10:24
>>35
情報不足。
(1)クローニングベクターのサイズ(bp)と、
 その切り出しに使用した制限酵素の名前とゲル精製後のサイズ
(2)発現用ベクターのサイズと、
 その切り出しに使用した制限酵素の名前ととゲル精製後のサイズ

これを教えれ。
とくに(1)の切り出しにひとつの制限酵素を使用した場合や
ふたつの制限酵素を使用した場合でもXbaIとSpeIなど
compatible endsとなる酵素対を使用した場合は
そのようにself ligationを起こす可能性が高くなるので、
mol比を1:3〜1:5くらいにするなど、注意が必要。

42 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 14:23:20
>>40
この板にいるのかな。獣医さんの領域だよね。。

43 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 16:43:01
制限酵素配列付きのプライマーでPCRした生成物をTOPOクローニングしたんですけど、
とれたものは、TOPOクローニングサイトではなく、まるで普通に切り貼りしたかのよ
うに制限酵素部位にインサートが入ったものだった、なんてことってありますか?

44 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 16:51:48
俺は聞いたことも体験したこともない。
あと考えてみたことも無い。シーケンス確認したらそうなってたの?

45 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 19:51:05
>>43
PCRの鋳型か何かがにプラスミドがコンタミしてたっていうオチじゃなくて?

46 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/17(金) 20:11:30
Gatewayを使っています。
DESTベクターで哺乳動物細胞に目的遺伝子を発現させて機能解析をしようと思ってるんですが、
遺伝子導入の際のmock controlは何を用いればいいんでしょう?
最初は空ベクターにすべきかと思ったんですが、そうするとベクターがある程度の量必要になり
ますが、インサートを持ってないDESTベクターは大腸菌では増やせませんよね?

47 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 00:00:51
現在ウェスタンによってあるタンパク質の増減を見ています
しかし抗体が良くないのか4℃ O/NしてABC染色してやっと見れるかどうかという感じです

それでもちゃんと見れるならまだいいのですが、ポジコンでもバンドの位置が微妙にずれたり変なノンスペが目的バンドより濃く出たり普通はリン酸化の影響でダブレットで出るはずの目的バンドがシングルバンドで出たりともう無茶苦茶です
ポジコンには以前に多めに調製した細胞破砕液を小分けして使っているのでサンプル自体は同じでゲルの濃度等も同じです

このような現象の起こる原因及び対処法があれば教えてくださいお願いします

48 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 00:08:43
>>43
そんなはずあるわけないだろ。誰かのいたずらか>>45の言うとおりだ。

49 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 00:17:22
>>46
お前のラボではDESTベクターは使い切ったら新たに購入してるのか?
金持ってるんだなw


50 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 01:42:52
うちなんかdestination vectorはみんな手作りだぜ。

51 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 04:26:08
InvitrogenのpcDNA3.1/zeoベクターにインサートいれようとしてるんですが、
このときフレームを考えて設計しないといけないんでしょうか?
GSTベクターのようにフレームを合わせるのはこのベクターの場合ない?
またコザック配列を含ませろと書いてあったんだけど、どんな配列をどのように含ませるの?


52 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 08:07:24
悪いことは言わないから、まず分子生物の基礎から勉強しろ。

53 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 09:14:51
>>51
必要ないよ。

KOZAKは。。。。
ど忘れしたな。GCCACC(ATG)G (ATGはスタートコドン)だったかな?
間違っていたらどなたかフォローたのんます。

54 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 09:23:17
おしいな
ATGの5'側はAがたくさん並んでてー3あたりにC/Aが正解

55 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 14:34:00
おれは今まで50種類くらい(長さは200−2000aa)作ったけど、
>>53の配列(GCCACCATG)で発現しなかったことないよ。
コンセンサスには入ってるけど、ATGの後のGは経験的にはいらないと
思ってる。


56 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 21:18:31
来月からBACのショットガンシークエンスを始める予定ですが、
目標は何倍くらい読めばいいのでしょうか。


57 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 21:41:49
うへー時代はそこまで来ているのか。
にちゃんでショットガンシークエンス計画立てるようなやつがでてくるとは。
ttp://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1355857&rev=1
ここでは2-10倍と言ってるが。

58 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/18(土) 23:39:36
>>49
>お前のラボではDESTベクターは使い切ったら新たに購入してるのか?
>金持ってるんだなw

え・・・マジで使い切るたびに購入してましたが・・・。
あれって増やせるんですか?
増やせないと思ってたので・・・。
どうやって増やしたらいいんですか?
普通に何かの大腸菌に入れて振盪培養?
抗生物質は何を?

ちなみに、お金は余ってます。

59 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 01:51:30
destなんて、6μ程度で4〜5万で買えるじゃん?

60 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 02:35:47
シーケンスがうまくいきません


61 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 03:13:32
お客様の中にエスパーの方はいらっしゃいますか?

62 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 03:33:30
>>60
君が下手
組成ミス
プライマー設計が怪しい
鋳型精製が汚い
機械の中の人の機嫌が悪い

63 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 07:36:10
>>58
じゃあどうやってvector作ると考えていたのか?
まあいいよ、マニュアルさえ読まず、
原理を理解していないような奴は、
国民の税金を無駄にinvitrogenに渡しておいてくれ。
いや俺はおそらく君と違う国にいるから。

と言いたいが、この業界を一緒くたに批判されて被害を被るのもなんだし、
ttp://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/C7510-03_001.shtml
こいつを買うのだ。
どうせこれ買ってもコンピ手作りはしないだろうが。
説明するとR12サイトに挟まれた所にあるccdBという遺伝子は、
普通の大腸菌を殺すが、この特殊なストレインはccdBに耐性で、
だから増えるという事だ。
もちろん暇があったらccdBが何をコードしていて、
このストレインがなぜ耐性なのか、知っておいてもそんはないかもしれん。

64 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 08:17:28
こういう先輩の下に付けたら幸せだったなぁ。。。

65 :51:2006/11/19(日) 14:05:19
>>53
>>54
>>55 サンクス
自分なりに調べてみたら、GCCACCATGGが必要とか、ACCATGGとか、CACCATGGとかでてるんだけどどれが正解?
>>53, >>55が言うようにGCCACCATGGが一番基本どおりなの?
ところでもひとつ、目的タンパクの前にコザック配列をつけるということだけど、コザック配列直後に目的タンパク配列を入れるの?
それか気持ち何塩基か余計に付けた後?
それともコザック配列中のATGと目的タンパクのATGは一緒にするの(Gも付けないといけないのにそれはないよね)?

66 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 17:30:37
>>63
親切だな、お前w
>>58のラボは金があるのはいいけど、助手も大学院生もポスドクもそろって
マニュアルも読まずに実験してるのか?
代理店やinvitrogenの営業は何も言ってこなかったの?
黙って入荷し続けたその代理店と取引するのはやめた方がいいと思うw

67 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 17:33:41
>>65
目的タンパクのATGをそのまま使えばOK
未知のものや膜タンパク質はN末端に変な配列ごちゃごちゃ
つけたり、アミノ酸変えたりしない方がいい。
ATGのあとのGはアミノ酸が変わるときはつけていない。
問題発生したことはないよ。

68 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 20:25:53
エチブロが怖いです

69 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/19(日) 23:45:06
>>63
>説明するとR12サイトに挟まれた所にあるccdBという遺伝子は、
>普通の大腸菌を殺すが、この特殊なストレインはccdBに耐性で、
>だから増えるという事だ。
おぉ!こんなモノがあろうとは!
テラアリガタス(´・ω・`)ノ
早速買ってみます。

>>66
>>58のラボは金があるのはいいけど、助手も大学院生もポスドクもそろって
>マニュアルも読まずに実験してるのか?
>代理店やinvitrogenの営業は何も言ってこなかったの?
いわゆるMolecularの実験やってるのは俺ぐらいなので。。
マニュアルは必要な箇所だけ拾い読みしてました。
代理店は何も。。

70 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 03:16:21
>>68
ぶっちゃけ、手についてもきれいに洗えばおk
気になるなら、ゴム手お勧め

71 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 15:33:49
>>69
悪いこといわないから代理店を変えろ
ふざけるな、変えるぞとごねるだけでも何かいいことがあるかもw


72 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 21:48:54
>>70
手袋つけてるから平気でエチブロに触る
         ↓
そのままドアノブや機器やらを触る

っていう感じでうちの研究室では明らかに逆効果なんだが

73 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 22:20:49
発光バクテリアの培養が上手くいかないよ(ノД`)
なんでだろう?もう3回くらいやってるのに全部駄目。
雑菌に負けてしまったんだろうか。

74 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/20(月) 23:06:46

これは質問なのか、それとも独白か?

75 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 04:40:12
>>72
エチブロ専用のゴム手か、使い捨ての手袋にするといい。
エツブロ触った後は、即廃棄

76 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 09:21:39
>>73 発光バクテリアってなんだろ?
海ホタルとかそうだっけ?

77 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 09:32:30
>>74
出来ればアドバイスを頂きたいです
>>76
イカの体表面に付着しているバクテリアのことです。
イカが夜光るのはその発光バクテリアのおかげなんだそうな。

培養するとペトリ皿の中で他の雑菌に負けて死滅してるorz


78 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 10:48:52
素人?
あるいはここには海洋微生物専門家は少ないと知っての愚痴か。
まずは単離からだろうね。

79 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/21(火) 11:08:16
>>77
培地は何種類か試したのか?

80 :51:2006/11/22(水) 02:14:59
>>67
つまりは配列のあたまにGCCACCをただくっつければいいということですな。
ありがとう

81 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 15:27:49
突っ込んだ遺伝子を発現させようと、
BL21(DE3)pLysのグリセロールストックから起こして培養したけど菌が増えないorz
これって、リゾチームのせいでグリセロールストックは厳禁?
それともグリセロール20%じゃいかんのか。う〜ん

82 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 17:23:41
w

83 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 18:38:44
>>81
本来なら増えるだろ。
抗生物質の種類間違ったとかじゃなくて?

84 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:04:27
エタ沈がとてつもなく苦手です
昨日もロスしました
制限酵素処理したあと酵素を熱で失活させればエタ沈しなくてそのまま
トランスフェクションしても大丈夫ですか?
やっぱりやった方がいい?

85 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:07:47
>>83
プレートのアンピシリンがダメになってて、変なコロニー拾ったかも知れません。
もう一度試してみます。

86 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:32:56
>>84
それはトランスフェクションが上手くいかない理由としてエタ沈だと考えているの?
その他のミスとかはまず無いということか?
>>83の言うような抗生剤を間違えているとか
そもそもプラスミドが無いとか
その辺の確認はしているの?

87 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 19:57:25
>>86
はい、プラスミドの有無と抗生剤の確認はしました。

88 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 20:05:32
>>86
>>84ですが、エタ沈の前後でABS280ががた落ちするんです。
μgオーダーあるはずなのに。。

89 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 20:47:29
>>85
もう一度試してみるという選択は間違ってないと思うけど、
プレートからコロニーをピックアップして、振盪培養するとき、
アンピシリン入りの培地使ってないの?

90 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 20:57:40
http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/b10.html
この方法で一周PCRして、3塩基を置換しようとしています。
PCR後、泳動して確認すると、元のプラスミドよりも少し大きい位置にバンドが現れました。
置換後でも塩基長は同じになるはずなので、同じ位置に出ると思っていたのですが、これって反応がうまくいっていないのでしょうか?
それとも、テンプレートのプラスミドは大腸菌から抽出したものなので、PCR産物の環状DNAとコイルの仕方が違ったりするのでしょうか?

91 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 21:29:11
>>90
PCR産物のプラスミドのバンドは何本?

仰せの通り 元とPCR産物にある微妙な構造の違いで
バンド位置が変わったり
或いは複数のバンドが見られることがある様なので
まだ試していなければですが
何かしらの制限酵素で鎖状にしてから
一度コントロールと流してみて下さい。

92 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 21:44:36
>>91
複数の置換変異体を作ろうとしているのですが、いくつかの変異体では、
かなり低分子量側にうっすらバンドがもう一本見えるものがありました。
ただし、メインのバンドはすべての変異体に共通した位置に出ていて、
ちょっと当たりっぽいかなと思っています。

とりあえず次の段階の形質転換と平行して制限酵素処理もしてみようと思います。

93 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 21:50:42
>>88
キャリアーを使えば?
キャリアーの自作が面倒だったらNIPPON Geneの「エタチンメイト」使うとか。

94 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 22:27:16
>>90
同じ鋳型から繰り返し複製することはPCRとは言わない。

95 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 22:30:21
>88
沈殿後に乾固させるじゃん?
あれ時間かけすぎるとDNAガチガチになって溶媒に溶けなくなるYO

または溶解用のTEにDNaseがコンタミ…はないかさすがに
うっかりDNase活性殺してないRNaseをTEに溶かして使ってたとか
(↑まさかと思うだろうが、俺はやった)

低レベルな回答ですんません

96 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/22(水) 22:30:30
>>84
フェノールorフェノール・クロロホルム抽出+エタ沈は必要でしょ。
エタ沈は大胆にデカンテーションで上清を捨てた後、軽く遠心して
チューブに残った50ul程の上清を、ペレットを吸わないようにピペット
チップで除くというのが最強。

97 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:27:50
二次元電気泳動→PVDF膜にブロット→免疫染色→スポットを切り出す→抗体をストリップ→メンブレン上で消化してTOF-MSで同定

っていう感じの実験をしたいのですが可能ですか?
ストリップをちゃんとやらないと抗体等の混入が心配ですがどうでしょう

98 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:31:54
免疫染色の時点でブロッキングに使用するスキムミルクやBSAが、、、

99 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:40:06
>>97
なんでそんな面倒なことするのか分からない。immune precipitationか抗体カラムつくって一発だし、
どうしても2次元電気泳動したいならその後にもできるし。

100 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 00:51:58
>>98
それが一番心配な点なんですが有機溶媒やらで丁寧に洗ったら何とかなりませんかね?

>>99
もちろんIPと抗体カラムは試しましたが
「目的タンパク質がごく少量しか存在しない」&「抗体価が弱い」
というダブルパンチで上手くいきませんでした

101 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 03:34:24
発現系次第だが収量を増やす努力も同時平行で行うこともお勧めする。

102 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/23(木) 23:52:29
BluscriptのEcoRIとBamHIをラーゲーションし、
その後大腸菌にトランスフォームした場合、
Bluescriptのダイマーを形成し、大腸菌の中で複製していくと考えていいのでしょうか?

103 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:31:43
>>102
日本語でおk

104 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:36:58
いや、日本語的にはまあまあだと思う。

105 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:37:39
いや、意味不明。

106 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:40:21
そのくらい読み取ってやれよ。うちの学生なんてもっとヒドいけど、何とか対処してやってるぞ。

107 :102:2006/11/24(金) 00:42:55
Bluescript is linealized with EcoRI and BamHI,
and the resultant DNA is done ligation,
and then transformed into E.coli.
In that case, the plasmid, as a dimer, is replicated in E.coli?

108 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:46:19
惜しい!

109 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:47:44
日本語で意味不明だったところが英語でもダメ。

110 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:57:04
そういうのが取れたことはないから、現実問題としては「まず無い」と言っていいと思うけど、
プラスミドの複製という観点で何か不都合あるかな。
全体が巨大なinverted repeatで不安定だろうけど、それは複製の問題とは別だもんな。

111 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 00:57:12
>>102
なにが目的でどんなことを知りたいのかわからない。
まずBluscriptのEcoRIサイトとBamHIサイトはライゲーションしない。
DNAってダイマーを形成するの?

112 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:03:04
EcoRI-EcoRI、BamHI-BamHIでライゲーションされた2倍のサイズの産物が
大腸菌内で安定に複製されるかって質問でしょ。

113 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:13:13
oriが二カ所あるプラスミドは安定して増えない

114 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:16:04
>110
ご回答ありがとうございました。
>111
ライゲーション時に、ベクターのみのコントロールを取る事があると思いますが、
その理由をきちんと抑えておきたかったので。
>112
そういうことです。
>113
ありがとうございます。

115 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 01:33:16
>109
113の日本語を英語に訳してみてよ。明日の正午までに。
君のすばらしい英語の回答を、ノートに書き込んでおくよ。

116 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 09:02:18
>>115
極端に長い inverted repeat のある配列は、大腸菌では増えない
ようです。プラスミドが逆向きにつながると 約3kbの inverted
repeat になってしまうので、増えません。プラスミドがタンデムに
つながったダイマーなら普通に複製できます。指定された>>113
英訳ではないが、
So plasmids with two ori sequences can be stably maintained
in E. coli.

最初の質問では、EcoRI と BamHI で二重切断したものを
ligation したのか、EcoRI で切ったものと BamHI で切ったものを
ligationしたのかがわかるように書かないといけないよ。

EcoRI digest and BamHI digest of pBluescript were
ligated, and then the ligation products were introduced
into E. coli. Is the resultant dimer molecule of
pBluescript replicates in E. coli?

117 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 09:23:34
can → cannot かな?

118 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 22:48:45
>>117
pBR、pUC、pBluescript などのColE1系のプラスミドなら can。
F因子などのstringentなプラスミドならcannot。


119 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/24(金) 22:56:08
ナメクジのパッチクランプ

120 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/25(土) 10:52:09
パッチクランプについて詳しく教えてください

121 :102:2006/11/27(月) 06:49:05
>116, 118
Wow! Thanks a lot.
Brilliant!

122 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/27(月) 12:31:15
>>119=>>120?
ナメクジでうまくいってないのか?そうなのか?えれーえ難しそうだけど、エレガンスのペーパーならあるっぽいよ。
哺乳類の脳神経のvivo-patchってのも出来るそうだし。

123 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/30(木) 10:16:23
国内でPhi-NX Cellを提供してるラボってありますか?
nolan-labに直接だとMTAがめんどくさい・・

124 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/30(木) 22:10:16
実験の副手やってる院生が嫌いです・・・

「お前ここはOOしたほうがいいに決まってんだろ!」
「な? あ? そうだろ?」
「それならなんでお前今XXしたん??」
「こうしたほうがいいだろ? おい? な?」

実験中は胃が痛くなります。
私の実験が下手だというのもあるでしょうが、これは耐えられません。
どうすればいいでしょうか

125 :名無しゲノムのクローンさん:2006/11/30(木) 22:28:52
>>124
俺はしがない助手だが
いまどき親しくも無い学生をオマエ呼ばわりしただけで
アカハラ認定ですよ。
学生にはみんな敬語で丁寧に話してます。

上司に相談すべし。

上司が取り合ってくれなかったら、
あなたが強くなるしかないでしょう。
ある程度のストレス耐性がないと仕事なんてやっていけませんからね。
自分が向上していくチャンスと考えて前向きに行きましょう。

126 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 01:58:50
最近の顕微鏡に附属のソフトを使えば、
簡単に緑と赤と・・をmergeすることが可能ですが、
まだお持ちでない方もいるかと存じます。
そこで、Photoshopを使ってFITCとRhodamineをmergeする方法を
アップしました。
この方法で以下のようなmerge画像が得られます。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/example.jpg

「Photoshopを使ってFITCとRhodamineをmergeする方法」
http://133.95.84.77/~sheel/merge/howtomerge.pdf

以下のURLからFITCイメージとRhodamineイメージの例を
ダウンロード可能で、これを使用して実際にmergeの練習ができます。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/exampleimages.zip

merge結果が以下の画像となります。
http://133.95.84.77/~sheel/merge/merge.jpg

127 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 10:36:13
Windowsで動くフリーのプライマー作製ソフトってありますか?

128 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 17:19:52
>>124
ぬるぽ。
最近の若い子って免疫ないのね。
うちのラボなんか教授が機嫌悪い時は口きいてくんなかったり
モノ飛んでくるのは当たり前ですよwww
基本的に(相手が横柄でも)教わってる、という立場としては
それを是としたほうが良いと個人的に思います。
ただ、よほど嫌なら>>125の言ってるように教授に相談してみる
と良いでしょう。


>>127
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi


129 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 21:49:19
>>124
「ここはOOしたほうが」「それならなんで」「こうしたほうがいいだろ」
にちゃんと反論できるようになれば立場は変わる。
それが出来ないならおとなしくしてなさい。
これは実験が上手いとか下手とかいう問題じゃない。

130 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/01(金) 23:27:10
>>124
そういう奴はむかつくがちゃんと教えてくれるだけマシと思え

>>127
http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm

131 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/02(土) 04:33:16
>>124
そういうのはな
「はぁ、そうだったんですか。気づきませんでした。勉強不足ですみません。
 ありがとうございます。他に気をつけるべきことはありますか?」
くらい聞いてちょうど良いんだよ。

教えてもらえるだけありがたいと思えwwww

で、もし反論出来るだけの根拠があるなら
「確かに○○も一つの手とは思いますが、私は〜〜の根拠に基づき、XXをしました。
 もし不備があるのでしたら、原理説明をお願いします」
くらい言え。ただし、君の知識が毛頭ないのに、注意されたくないだけとか言うくだらない
自尊心からくるだけの反抗なら、下手に出とけ。

132 :124:2006/12/02(土) 17:04:57
スレ違いなのにお答えくだすった皆さんありがとうございます。

いろいろあったけど、私は元気でした

133 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/02(土) 17:23:04
魔女宅オチかよ・・・・・

134 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/03(日) 08:55:00
過去形か。

あの世から乙

135 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/03(日) 10:31:37
>>126
http://science4.2ch.net/test/read.cgi/life/1036510268
こちらへ...

136 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/04(月) 18:17:05
基本的な質問で申し訳ないのですが,2mm四方程度のマウス組織から(一応これらの組織の
数は10個程度までは増やせそうです)RNA抽出して、アレイに持っていきたいのですがなか
なか収量が稼げません。一応TorizolやRneasy等は試してみたのですが。。。

一応可能であれば、one-cycleでやるため1-5μg程度は必要で、two-cycle(10-100ng)も
考えています。どちらにせよ100ng以上ほしいのですが。。。何か良いアイディアありますか?

137 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/05(火) 11:10:07
そもそもその体積の組織標本に含まれる以上のRNAはとれないが、
その辺は押さえているのだろうか?
いや詳しくは知らんが。

138 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/05(火) 20:03:54
以前、カメの採血方法を質問したものです。
今回、カメの採血に成功しました。
単純にカメの後ろ足を1cmほど切って、
ポタポタ法で採血しました。
その後はsacrifyしますた。

以上、報告まで。

139 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/05(火) 20:10:09
>>138
そんなこといちいち報告すんなやボケ!
あー胸糞悪い!

140 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 10:06:42
>>139
なにファビョってんの?

141 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 10:57:14
どうせSacrifyするなら、暖冬して逆さ釣り。そん時に頚動脈や頚静脈とか当たりつけておいて次はカニュレーションに挑戦

142 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 23:22:21
まな板の上に乗っけてね
甲羅にお湯かけて
首がニューと伸びてきたところを
こう
包丁ですぱーんと
あと
ちっちゃなグラスに血を採ってからね
焼酎で薄めてお出しします


143 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/06(水) 23:27:38
>>142
それは実験じゃなくて調理という。

144 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/07(木) 02:14:52
どうも。現スレ >>5 です。

お陰様で30℃培養でpETに目的の遺伝子を正しい方向に挿入することが出来ました。
有り難うございました。

抗生物質耐性遺伝子以外は同じプラスミド両方で実験をしてみて、コロニーの当たりの
確率を見て思ったのですが、毒性の高い遺伝子は KanR のプラスミドよりも AmpR の
プラスミドに入りやすいということはありますか?

あと、私は、他の仕事の合間にやってて遅くなったのですが(言い訳w)、皆さん、
発現系ってだいたいどのくらいの時間で構築できるものなのですか?



145 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/07(木) 23:34:36
>>144
>毒性の高い遺伝子は KanR のプラスミドよりも AmpR のプラスミドに入りやすいということはありますか?
そんなの聞いたことないけどなあ
他のベクターの特性じゃない?

>発現系ってだいたいどのくらいの時間で構築できるものなのですか?
cDNAから釣ってくるところから始める場合は2〜3週間ぐらいかな
まあ、サイズとか制限酵素サイトとかにもよるけど

146 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 03:15:19
カナマイの濃度下げると取れることは確かにあった。

147 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 22:13:21

T7とかSP6とかのRNApolymeraseでin vitro transcriptionすると、必ずバンドが二本出るんだが、
あれってなんなの?

148 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 23:13:58
転写産物+鋳型

149 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 23:24:20
ンなわけねえだろカス
二次構造だよ

150 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/08(金) 23:28:33
サイズの小さなコロニーを選んでピックアップするとインサート当たりが良かったことがある。

151 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 00:28:40
俺もそれは聞いたことがある
インサートが入ってる分だけ負担が大きい(?)からだとか

ただ、小さいのはサテライトの可能性もある

152 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 00:39:01
LB plateじゃなくてM9 plateを使うとインサートのあたりが増えることがあるよ

153 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 13:31:23
逆に大きい方が当たったりする事もあるらしいがな、
抗生物質の効きが弱い時は。

154 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 13:56:13
>>152原理はどう説明つける?
いや証明しなくてもいいのだよ、
それなりに納得のいく説明なら。

155 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 17:53:35
誰か、NEB社のGPS-M Mutagenesis System(トランスポゾンを飛ばすやつ)を使って、
ゲノムライブラリーに変異を導入した人いませんか?
全く変異が入らず、早1ヶ月。
このキットで成功した人がいたら、いろいろ聞きたいんですが、
よろしくお願いします。

156 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/09(土) 17:56:30
>>154
経験則に原理説明ってのは、非科学的だな。

157 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 10:10:44
>>156 何を言っているやら。
ある面白い現象を見つけた何度か再現をとる、
そして再現性がみられるなら原理の仮説を立て、
仮説を検証できる実験系を構築し実験をし、
その結果から仮説が正しいかどうか考える。
サイエンスそのものだろ。

別に証明しなくていいっていってるさ、それは時間も金もかかる。
本業でなければそんな手間はかけれない。
でもなぜそうなるのか、仮説を立てるのは暇な時間にできること。
ちょっとした気晴らしみたいなもんだ。
それをここに書きこんでくれたら、
みんなであーでもないこーでもないとヨタ話ができる。

158 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 12:50:19
あるタンパクのリン酸化部位の同定を目指しています。
そこでGST融合タンパク質を作成し、それを基質にしてKinase assay を行いました。
その融合タンパク質の全てのリン酸化可能な残基に変異を導入したにもかかわらず、
リン酸化されてしまいます。GSTがリン酸化されている可能性はありますか。
ほかに何か原因があるのでしょうか。どなたか経験のあるかたアドバイスください。

159 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 12:56:46
リン酸化されたと結論したその実験の詳細を述べるべき。

160 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 12:58:56
pGEXの空べくたーから発現させたGSTがリン酸化されることはよくある

Hisx6タグベクターに移せ

pQE9がお勧め

161 :158:2006/12/10(日) 14:05:19
もう少し詳しく述べると、
目的タンパク質の部分配列35アミノ酸をGSTに付加しGSHビーズでタンパクを
精製しました。それを32P-ATP 存在下に細胞ライセートと混和し30度30分
インキュベートした後PAGEで展開しオートラしました。
ネガコンのGSTのバンドは検出されませんが、目的タンパクの野生型、変異型
ともに同程度の強さのバンドが検出されました。変異型は全てのSer,Thrを
Alaに変えてあります。Y はありません。
タンパクまたはペプチドの融合でGSTのリン酸化が促されるということはあるのでしょうか。

また、短い断片なのでGSTをタグに泳動で確認したいのですが、Hisで発現させると
Kinase assayはPhospho-celluloseを使ってスポットの検出になるのでしょうか。
よろしくお願いします。


162 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/10(日) 23:25:59
0分はどうかな

163 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/11(月) 07:43:28
Native−Page
発現させたタンパク質を変性させないで電気泳動するなんてどう?
非還元SDS−PAGEでもいいと思う。
同一ゲルでサンプルの処理方法を変えて流してみるというのも面白そうだね。
PAGEで展開されたそうだがどのようなPAGEだったのかがわからないから何ともだけど。

164 :158:2006/12/11(月) 09:53:32
>>163
少し分りにくいので教えてほしいのですが
泳動の条件を変えることでどのような結果が期待されるのでしょうか?

ちなみに、サンプルは数回ビーズを洗浄した後に
サンプルバッファーを加え還元条件でボイルしました。
電気泳動は12%SDS−PAGEです。
クマシーで染色後、ろ紙上で乾燥させてからオートラです。

165 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/11(月) 10:08:32
GSTだけだと内在性キナーゼの親和性が低くてGST自体のSer/Thr側鎖も基質にならんけど、
Ser/Thrを潰したpseudo基質配列を融合したGSTの場合、内在性キナーゼとpseudo基質ペプチド
強く結合したんで、そのキナーゼが手近にあるGST自体のSer/Thrを無理矢理リン酸化したんだろうか。


166 :158:2006/12/11(月) 11:17:52
ご意見ありがとうございます。
キナーゼの特異性はそんなものなのでしょうか?
それと、もしご存知なら教えてもらいたいのですが、
キナーゼ結合部位とそのリン酸化部位は近くかほぼ同じと
私も認識していますが、どれくらいの範囲なのでしょうか。不勉強ですみません。
BamH1を使ったのでそれがコードするSerが10アミノ酸ほど上流にあります。
これを潰してみようと思いますが、だめなら手を変えてみます。

すでに結構な時間を費やしたのでGSTを捨てるのはおしいのですが、仕方ありません...
なにかアイデアがあればよろしくお願いします。

167 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 11:06:07
俺は詳しくないのであまり真に受けないでほしいが、
>>160が経験者のようでよくあるとのこと、
彼のHisにしろ、というのはもっとも良さそうなアドバイスに見える。

あるいは可能性は低いがGSTフュージョンに結合する、
似たようなサイズのものが検出されているとか。
これを検証するにはライセートとP32ATPのみでリン酸化反応をし、
カイネースインヒビターいれてから、
あるいは酵素が働かない低温にしてから、
GSTフュージョンを混ぜるというのはどうか。

168 :158:2006/12/12(火) 12:07:24
実際にいくつかの非特異的なバンドも見られますから、似たようなサイズのものを見ている
可能性は否定できませんね。いろいろコントロールをたててまたやってみます。
タグを換えるのも前向きに考えます。

169 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 14:51:50
MAPK系を動かす受容体シグナルを入れようと思い、EGFRを過剰発現させたところ、
リガンドを添加していないのにMAPKが活性化してしまいました。
EGFRはどうやら局所濃度依存的に活性化されてしまうらしいのですが(1)、このせい
でしょうか?
だとすると、何かもっといい受容体はありませんか?
過剰発現してもまったく影響がなくて、リガンドを与えた途端にドラスティックにMAPK
が動き出すような。
できれば膜一回貫通型がいいです。

(1) Cell. 2006 Jun 16;125(6):1137-49

170 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 15:22:50
PMAでもぶっかけたら?

171 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 16:10:11
>>170
いやー、訳あって、膜を介する受容体シグナルでないとまずいんです。
EGFなら一番有名だからOKかな〜と軽く考えていたんですが。。

172 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 19:40:27
>>169
培地の血清は抜いたよね?

173 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 20:38:44
インスリン受容体でもあかんのけ?>>171

174 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 20:47:26
>>172
Yes, of course!

>>173
インシュリン受容体ってバックグラウンド低いですか?
だったらいい感じですが。

175 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 23:11:29
>>174
大気中のヴィスファチンが結合するのでバックは決して低くないって
シモピーズが言っていたぞw

176 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/12(火) 23:26:41
過剰発現する必要はあるのか?

177 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 10:07:21
おはようございます。

>>175
ヴィスファチンってなんだか分からなかったのでググってみましたが・・・
大気中・・・!?

>>176
それが、あるんです。。
詳しくは実験のコンセプトを口外できないので言えないんですが。

とりあえず、FGFRかTGFβRあたりでやってみようかと思ってます。
免疫系の受容体なんかもいいですかね?

178 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 12:03:58
そんな研究はアーティファクトを報告するだけじゃないのか?

179 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 13:52:42
>>178
生理現象を明らかにする研究ではなく、技術開発なんです。
もちろんアーティファクトはあっては困るんですけど。

180 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 22:48:39
エタ沈用に
エタノールと酢酸ナトリウムをあらかじめ混ぜて保存しとくのってOK?
なんか害ある?

181 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:26:38
>>180
エタ沈の原理を勉強してから出直して来い

182 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:43:02
>>180
okだったはず。俺もやってるし

183 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:47:41
酢酸ナトリウムが沈殿しないか?

184 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/13(水) 23:54:39
酢酸エチルができそうな気がしないか?

185 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:17:34
俺も気になる
説得力のある答えきぼんぬ

186 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:18:38
ナメクジの実験がことごとく再現できない

187 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:31:36
粘着してるね。で、主犯は誰なの?

188 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/14(木) 00:38:29
まずは偉そうな>>181に答えて欲しいね。

189 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 03:16:11
>>180
混ぜとくってのは普通だけど、それで放置はどうか知らん。
一日くらいなら大丈夫な気はするが、作り置き放置プレーは保証できない

190 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 15:40:19
>>180
まーあれだ。
特に問題なさそうな気がするんだが、結局のところ

   お 前 が 人 柱 に な れ

ってことだな。
結果レポよろしこ。

191 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 16:46:21
ネットでしらべたけど、イソプロとNaOAc混ぜると沈殿するけどエタノールの時は大丈夫らしいね
でも昨日プレミックス作ってシーケンスサンプルエタチンしたけど、フリーのdNTPに比べてシグナルのピークが弱かったんだが、、、、
1000bまでは読めてたけど、、、

192 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 17:01:19
まぁその都度混ぜた方が無難ではあるよね

193 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/15(金) 17:21:27
プロフ見てくれた?プロフの写真からメッセージ下さいね
http://kurabujp3.nobody.jp/

194 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 00:25:19
というわけでさらしあげとく

>>181
>>181
>>181
>>181
>>181
>>181
>>181

195 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 00:52:25
初級の分子生物学実験の話題になるととても偉そうに痛いこと書き込む
奴が現れるよね。

196 :182:2006/12/16(土) 01:59:25
>>191
イソプロは駄目なのか!
今まで普通に使ってて、沈殿も見たこと無いけど・・・。
明日、沈殿してるかしっかり確認してみよっと。

結局塩無しのエタノールもよく使うから、
混ぜてても場所とるだけで、あまり意味ないんだよな。
塩の量の計算もめんどくさいし、エタ沈するときにも
入れる量の計算が微妙だし・・・

197 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 09:29:18
塩入れなくても結構沈殿するからね
多少はロスってるかもね

198 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:10:32
相違や最近はほとんどエタ沈してない。
ミニプレで磯プロ賃だから塩なんか半年ぐらい入れてないや。

199 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:18:23
もうすぐ卒論提出のおれに質問させてください。

おれは精巣を解離して、特定の細胞だけを極細のピペットで一個ずつ何百個か回収して、
その細胞で特異的に発現しとる遺伝子を見つけたいなって思ってる学部4年です。

それで、回収してきた細胞を固定して切片にしてHE染色して、精巣の組織切片
と比較した上でちゃんと目当ての細胞だけを集めたってことを示す必要があると
思うんです。

でも細胞をシングルで(または数十個まとめて)固定すると収縮してしまって、
組織切片での像とかなり変わってしまうので困ってます。
回収した細胞を低融点ゲル(pH、浸透圧ともに調整済)に入れて、冷やして
固めてそれを固定→切片というふうにやってます。
固定液を色々変えてみたのですが、いい切片像は得られませんでした。

できる限り組織切片での像と同じような像をシングルの細胞でも得られるように
する為に、何かいい方法はないでしょうか。

200 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:31:05
>>199
血球細胞の回収に使うサイトスピンっていう遠心機を使って
スライドグラスに回収した細胞を貼り付けて染色しなさい。
免疫とか血液をやっているラボなら必ずあるから、探して借りなさい。
切片でやっている限りはきれいなデータにはならないよ。

201 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:42:51
>>200
レスありがとございます。サイトスピンですか、調べてみます。
その方法で染色したとして、何と比較すればいいのでしょうか。
組織切片に似たような像にはならないですよね??

202 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:46:32
>>201
精巣の細胞だから核の形で分かるだろ。
これは切片だろうが回収した細胞だろうが基本的に変わらん。

203 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 12:47:00
俺はHE染色像でやる必要性がいまいちわからない。
HE染色以外にその周辺にある細胞と区別する方法が、
全然ないのだろうか?
モノクロとかとれていないのか?

204 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:11:55
>>202
確かに細胞懸濁液の状態でも核の形態から、たぶんこれが目当ての細胞だろうとわかるのですが、
確たる証拠が要るのではないかと考えています。
これまでに精巣構成細胞の同定は精巣の組織切片上でしか行われておらず、細胞懸濁液での
同定は例がありません(たぶん・・・)。ボスに見てもらっても、細胞の大きさ、核の形態
から言って「たぶん」間違いないだろうとは言われるのですが、ほんとうに間違いないのか
が気になるんです。

>>203
モノクロというとモノクローナル抗体ってことですか(知識なくてすいません。。)?
現在はまだ見つかっていないです。僕も分子マーカーがあればと思ったんですが、
ないのでやはり組織切片像に似せるしかないかなと思っています。


>>203

205 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:49:12
へー、精巣ってそんなレベルだったんだ。
すげー意外。

206 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:53:49
組織上での鑑別ではHE染色のみでやってるの?免疫染色ではなくても、
色々な染色法による染色性の違いなんかはないのかな。

207 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 13:55:03
>>205 はっきり言ってやれよ。もっと調べろ、と。

208 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 14:01:59
>>207
1970年代のような錯覚を覚えたw

209 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 14:07:20
なにそれ?

210 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 15:12:35
精巣の細胞って、歳暮細胞か?支持細胞だとしたらLeidig細胞かSerotri細胞か?
いずれにしても、マーカーが無いとはとても思えないなw

211 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 16:53:03
>>206
これまでHE染色のみでした。染色法を変えることは考えていなかったので、
ほかの染色法についてもしらべてみます。ありがとです。

>>210
第一精原細胞です。もしかしてマーカーあるんでしょうか。
調べ方が足りなかったかもです。すいませんもっと調べてみます。

212 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/16(土) 19:49:27
レプトテンとかザイゴテンかな

213 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/17(日) 16:11:54
  

214 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/18(月) 15:21:41
色々なタンパク(リン酸化タンパク含む)のウェスタンに使えるブロッキング剤を
探しているんですが、市販品でお薦めありますか?
今みたところこういうのがあるようなんですが、いいですかね?
http://www.funakoshi.co.jp/h_news/0410/041025_PCCs.php

215 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/18(月) 17:56:04
>>214
たっけー!
研究室お金持ちならいんじゃね?

216 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/19(火) 00:31:12
>>214
成分無調製豆乳

217 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 16:45:04
制限酵素配列付きプライマーでのRT-PCRで取ってきた遺伝子がデータベースと違う部分が
ある上に、使う予定だったレアな制限酵素配列付きになっていました。

・ポイントミューテーションで予定外の制限酵素サイト潰す
・別の制限酵素サイト使ってPCRから

などが思いつきますが、どっちが楽でしょう?
また、ほかにもっと良い方法ありますか?

218 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 17:15:10
>>217
TOPOクローニング

219 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 19:09:17
オリゴ注文

220 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/26(火) 19:09:48
pcrの

221 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/27(水) 00:16:29
>>220
なんだそれ
気になるじゃねぇかw

222 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/28(木) 15:04:47
>>217
俺も最近はTOPOとGatewayばっか。
制限酵素なんて久しく使ってねえな。

223 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/29(金) 18:00:05
96welフォーマットで、均一で簡便にある程度質のいい、
プラスミドを抽出できるキットはなにかありませんか?
今使ってるpurelinkはムラがあるんだけど、培養方法が悪いのかな

224 :223:2006/12/29(金) 18:36:04
ムラってのは、プレートの左か右が、ごそっとシーケンスで読めない
泳動してないからプラスミドがとれてないのかどうかしらんが
培養はTB培地、タイテックの水平偏心運動で1000rpmで16時間くらい
これは培養のせいなのかキットのせいなのか

225 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/29(金) 22:30:40
ここで聴くよりまず泳動しろよ、な。

226 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/30(土) 00:25:38
>>225
知らないんなら発言しなくていいよカスwwww

227 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/30(土) 00:39:07
カスはテメエだろが。
プラスミドが取れてるかどうかで、
可能性の範疇が全然違うことも分からんのか。

人には向き不向きがあるんだってことが、今日よーく分かったよw

228 :名無しゲノムのクローンさん:2006/12/30(土) 01:02:33
やったことがある人ならその辺も含めてわかるよ
知らないことにまで口だそうとするなよ低脳www

229 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/04(木) 11:39:05
>217 亀レスだが
まず内部の制限酵素サイトが運良くメチル化で切れない状況になってないか調べる
駄目ならクローニングに使ったベクターのMCSの酵素が使えないか調べる
それでも駄目なら元々使いたかった酵素の2箇所の内側で切れる酵素を使って
インサート断片を二つに分けて次に入れたいベクターと3ピースライゲーション

230 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 06:22:33
(質問1)
細菌からDNAを抽出するときの
100度で熱抽出のプロトコールを教えていただけませんか?
また、熱抽出するメリットやデメリットも
よかったら教えていただけますと幸いです。
(PCRのかかり具合が良い、など)

(質問2)
血液を
proteinaseK+lysisBufferで一晩放置後にフェノクロしてイソプロ抽出
してみましたけどなんか純度が悪いのかPCRがうまくかかりません。
血液からDNAを抽出するときって、キット以外の正攻法としては
どんなのがありますか?

231 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 06:33:52
全血はあかん
遠心分離して血球だけにしてやってみ
それでもだめなら
ヘパリン入れて静置して白血球だけ取り分けて
やってみ

232 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 10:55:45
学校で、豚の目と、鶏の脳の解剖したせいで、お肉があまり美味しく頂けなくなった。
目に剃刀を入れたときに出る液体や、頭蓋骨を外すときの音、豚さんと鶏さんの匂いがフラッシュバックする……

233 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 11:36:08
>>228
わかるよ、じゃねえよカスw
シークエンスも満足に出来ねぇクズのくせによw

234 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 12:25:59
>230 アルカリ法とBoil prepでプラスミド抽出する場合の比較かな?
Boil Prepの利点
・試薬が安価かつ1.5mlチューブで培養からDNA保存まで兼用できて経済的
・操作工程が短く楽チンで速い。まとめて作業するのに向くので手作業でも48サンプルとか余裕。

デメリット
・若干DNAが汚い(ABIのシーケンスキットはそのままでは
反応がかからないので、以下とは別の変法も作った)

PCRに関してはColony PCRでもおkだし、DNAを十分薄めればかかると思う
漏れが常用してるプロトコルはこんな感じ
1) 1.5mlチューブでLB1.0mlでO/N culture(12h以上)
2) 遠心して培地をアスピレーターで吸って捨てる
3) 100μl STET + 10μlリゾチームでVoltex(完全に懸濁させる)して一呼吸
4) 35秒煮えたぎる熱湯の中につけて引き出す
5) 軽く2回程度shake(ゲノムDNAを軽く切断してペレットをコンパクトに)
6) 10分間最高速(14krpm程度?)で遠心
7) ペレットをつまようじにくっつけて除く
8) 110μl イソプロを加えて良く混ぜて一呼吸
9) 10分間最高速で遠心
10) 液をアスピレーターで吸って捨てる
11) 70%エタノール500μlを入れペレットとチューブ全体をwash
12) 5分間最高速で遠心
13) 液をアスピレーターで吸って捨てる
14) 乾燥後、40μl TE/RNaseに溶かして完了
試薬など ttp://cancer.ucsd.edu/howelllab/Mini%20Prep%20by%20Boiling.html

235 :230:2007/01/06(土) 17:08:46
>>231
ありがとうございます。
全血はダメなんですね・・・。
なんかめんどくさいのでやっぱりキットでやってみます。
>>234
ありがとうございます。
アルカリ法しか知らなかったのですが、
論文読んでると熱抽出とか書いてあって単にラクチンかな、
と思ったので・・・。
プロトコルまでいただいて感謝です!
やってみます。

236 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/06(土) 21:49:03
最近の学生はプロトコールブック一つ読まないで
ネットの掲示板で質問するのか・・・・・

237 :230:2007/01/08(月) 11:21:51
>>236
プロトコールブックっていうのがあるのですか?
上記のDNA熱抽出が載っている本があったら教えろや、カスが。

238 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 11:45:50
>>236
 
ま、ゆとり教育世代は__揃いだから仕方ないんじゃない?www

239 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 12:48:51
えー?>>237って本当に>>230
もしそうならちょっと良くないよなって自分でも思うでしょう。
こういう人っていて当然なの?>>教員の方
それならやっぱり院にいる人ってちょっとへん。

240 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 13:17:58
なにいってんの?
最近の学生は年上にため口聞いたり掃除当番すっぽかしたりするような奴ばっかりだよw


241 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 13:31:30
うーむ。やっぱ一万人計画はダメだな。
教えてもらう人にカスとか、信じられん。

242 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 13:48:59
皆様釣りはスルーで。<カス

243 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 15:37:48
ところで細菌培養のときに培地に均等に塗るためのあの先が三角形みたいになってるガラスのバーってなんていうんだっけか?

244 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 16:05:00
先が三角形みたいになってるガラスのバー
だろ

245 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 16:16:06
>>244
おいおい、嘘教えるなよw

正解は「上手く塗布できる棒」、通称「うまい棒」だよ

246 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 16:46:55
すぷれっだー
自作するんだよ

247 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 17:38:31
コンラージ棒って呼ぶ人もいるでよ

248 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 21:41:40
コンラージ棒、略して「こん棒」

249 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/08(月) 23:09:34
俺は自分の如意棒で塗ってるけどな。

250 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 02:22:34
>>249
まき終わったらちゃんと火であぶって滅菌しとけよw

251 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 12:13:21
>>249-250
弁当噴いたwwwwwww

252 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 12:49:28
>>249
当然エタノールに漬けるんだよな?

253 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 14:27:09
>>249
それはなんていう性病の検査なんですか?

254 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 20:32:49
「のびろ、如意棒ォーーーーッッッッ!! ・・・・・・・ダメだ、のびねえ」

255 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 21:04:58
>>252

ヘネシー・フェラ?
ナポレオン・フェラ?
VSOP・フェラ?

256 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/09(火) 23:18:06
>>255
男なら「まむし焼酎」

257 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 04:15:14
サザンのメンブレン(ナイロン)をリプローブしたいと思っています。
皆さん推薦のプロトコールありませんか?


258 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 04:19:47
PCRしろ

259 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 08:56:05
誰か、selectionするときのG418濃度教えてくれ
使ってる細胞はHela
kill curve作るのめんどくせえ

260 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 20:44:56
>>257
そんくらい自分で調べろカス

261 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 21:36:28
マルチクローニングサイトの下流にccdBがくっついてて、セルフしたやつは
ccdBが発現して菌が死ぬというTAベクター(pCR-4 invitrogen)を使ってPCR産物を
そのベクターにインサートしたんだが、セルフが結構ある。。。orz

同じ経験あるひといる?? ライゲーションの時に何塩基か削れてフレームシフト
しちゃったのか??

262 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 21:40:25
>>261
なんでそんなベクター選んだの

263 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 21:46:48
>>262
GATEWAYも使ってない貧乏時代遅れラボのやつは恥書くから書き込まないほうがいいよw

264 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 21:50:35
シーケンスした?
プライマーダイマーとか短い断片が入ってんじゃねえ?

265 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 21:56:22
>>263
(´・∀・`)ヘー
さぞかし貴方は最先端の研究をやってるんでしょうね。
どうせ俺は極貧ラボのヤル気の無いM2ですよ・・・orz

266 :262:2007/01/10(水) 22:57:10
>>262
うちのラボにはTベクターこれしかなかったんだよ、、

>>264
明日やる予定! 確かにダイまーの可能性はあるよなあ。サンクス!

267 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:02:16
コロピーやって5ul位の液(100ngくらいのDNA量)を精製してシーケンスするための
良い精製キットある?
溶出量が多いと薄すぎでそのままシーケンスできないんじゃないかとおもうが、
コロピーの反応量増やさずに、良いほうほうがあったらおしえてちょ

268 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:18:25
これで決まりだと思いますよ。
ttp://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=574

269 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:18:49
>>267
Milliporeのやつ。
名前は忘れた。

270 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:23:42
>>268
これいいね。
でも塩が心配なんだが、BigDye ver3.1でABI3100

271 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:23:53
>>268
それって、クローニング前のPCR産物の精製に使うとヤバそうな気がするんだけど・・・


272 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:24:53
途中で送信しちゃった

>>268

塩が心配なんだが、BigDye ver3.1でABI3100 POP7で1000bpくらいは読める?

273 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/10(水) 23:28:57
>>271
シーケンス用って書いてあるじゃねえか。

274 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 00:16:24
>262
コンピにLaqI過剰発現株を使ってないか?
DH5αとかなら良いんだが、XL10Gold、JM109、JM110とかみたいに
LaqI^qの株ではLaqプロモーターでccdBの発現がブロックされるから、
どうしてもそういった菌を使うときはIPTGを塗らないといけない。

なお、laqIは通常の株でも多少は持っているためか、変異のためか、空プラスミドの菌は、
インサートの入ってるコロニーより生育の悪いコロニーとして出てくる

漏れはTAクローニングはうまくいったためしが無いのでKOD polymeraseで
回数ぶん回してPCR-Bluntにいれてるんだが、TAクローニングで聞く話としては
ケチってTベクターを薄めて保存->凍結再融解し過ぎ->Tが外れる
というのはあるな。あと、プライマー設計次第ではAハングになりにくいとか、
手際が悪くてAが外れるとか。周りでもうまく行ってるかどうかによる罠。

275 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 05:48:45
>>268
PCR反応液10μlあたり0.1μlでおK
BigDye ver3.1でABI3100 POP7でいいとこ900bpぐらいか

276 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 12:24:56
>>275
thanks
もう一つ質問
ローディングバッファーははいってると駄目だよな?

277 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 19:37:50
制限酵素のオマケについてくるようなローディングバッファはダメ
教科書通りのローディングバッファもダメ
酵素反応を阻害しないローディングバッファを自作しろ

278 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 21:47:43
PCR反応に一緒に入れられるローディングダイ(バッファーじゃないだろ?)ならOK

279 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 21:58:51
そういえばうちの修士にも、試薬は何でもバッファーって呼んでる奴がいる。

280 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 22:24:41
>>279
ウチにもいる。どうやら
「溶液」=「バッファー」
だと思ってるっぽい・・・
面白いから放置してるけど。

281 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 22:30:38
"loading buffer" の検索結果 約 769,000 件
"loading dye" の検索結果 約 180,000 件

282 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 22:47:42
世の中、馬鹿の方が多いってことかw

283 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 22:58:14
"loading buffer" の検索結果のうち 日本語のページ 約 663 件
"loading dye" の検索結果のうち 日本語のページ 約 302 件

"loading buffer" の検索結果 約 769,000 件
"loading dye" の検索結果 約 180,000 件

"loading buffer" の日本語のページ率=0.08%
"loading dye" の日本語のページ率=0.16%

ということで、溶液をバッファーと呼ぶのを勘違いだと思ってるのは、
辞書で直訳して英語を勉強したバカだ
ということです。

284 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:19:43
はぁ?w
多数決で正解が決まるなら、サイエンスは必要ないだろ。
そもそもこの世の中、利口な奴より馬鹿が多いのは当たり前じゃないのか?

緩衝作用のない溶液のどこがバッファーだって言うんだよ?w

285 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:27:02
まあそう言うな。
ゆとり世代がネットで検索ができるようになっただけでも良しとしようよ。

286 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:31:52
>>284
統計はサイエンスじゃないとでも?w

287 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:32:01
約 663 件、約 302 件って物言いだけで、こいつがどういうレベルかは十分わかるだろw

288 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:33:13
>>286
誰がそんなこと言ってるんだよ、このカスめがw

289 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:33:22
>>284
それに割合で物語ってるのに多数決ってw
中学くらいの数学勉強しなおしたほうがいいと思うよ

"loading buffer" の日本語のページ率=0.08%
"loading dye" の日本語のページ率=0.16%

290 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:33:46
溶液はもちろんbufferじゃないけど、例えばDNA用のだとEDTA入っているし、bufferといって
差し支えないだろうな。その辺分かってればいいんじゃない?系によって違うけどそもそも
電気泳動だからpH変わってしまうのは問題だしね。

291 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:34:18
>>287
googleからコピペしただけですよ?低脳w
検索エンジンくらい使い方覚えろよw

292 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:34:27
>>286
そのデータは、馬鹿が利口より多いってことを統計的に示してますよ、確かにね。

293 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:35:27
ただでさえ初歩的な質問と答えばかりのスレッドなのに、そんな
くだらないことでもめてさらにレベルを低下させるのはやめろw

294 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:36:36
>>291
日本語の「約」ってのがどういう使い方をすべき言葉か、
お得意のGoogleで確かめてみてはどうか?w

295 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:40:07
>>294
googleってのは、検索結果に偶然性があって、同じ時間に同じ検索単語検索しても、
結果の数がわずかに変わるときがあるから、
「約」を必ずつけているのであるから、何の問題もありませんが?

論破されまくりですね。あなたw

296 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:40:09
このスレを見ている人はこんなスレも見ています。(ver 0.20)
一緒に行く友達がいない人同士で食べ放題に行くオフ [定期OFF]

友達がいないからぐぐって面白いこと言ってるの?
それとも友達がいないからくだらないことに突っ込み入れてえらそうにしてるの?


297 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:42:42
>>296

おいおい、、、
それって自分の履歴を表示するだましソフトだけど、
本気で言ってる?

298 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:42:43
>>295
論破したつもり、と日記にでも書いとけw

299 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:44:05
で、緩衝能を期待していないのにバッファーって、英語とか日本語とかの問題なのか?

300 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:45:08
>それって自分の履歴を表示するだましソフトだけど、
>本気で言ってる?
www

301 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:45:18
2chなんかで必死に論破するより、一報でも多くペーパー書いた方が良いですよ?

302 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:48:29
どうやらくだらないことにつっこんで偉そうにしてる方が友達いないみたい
だね。


303 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:48:36
全くだ。ただし、論文のMaterials and Methodsにはloading bufferとか書かない方が良い気がする。

304 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:55:32
なんとentrezでも"loading buffer"40にたいして"loading dye"37でした

305 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/11(木) 23:59:28
今北産業だが>>283は、緩衝液かどうかとは無関係に実験に使う試薬溶液を
バッファーと呼ぶことは正当だって言いたいのか?まさかそうなのか?
いくらなんでも、そんなことはナンセンスだろ。たとえGoogleの検索結果がどうであれ。

306 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/12(金) 00:01:04
>>304
世の中にはloadingに使われる緩衝液だってあるよ。
それと、緩衝能のないloading dyeをloading bufferと呼ぶこととは別問題だよ。

307 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/12(金) 00:29:22
激しくどうでもいい

308 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/12(金) 02:53:14
"gel loading buffer"を商品名にしてるメーカーが
いくつかあるようだな
インビトロとかさ死熊有怒立地とかさ。
だから商品名や登録商標やその略号が一般名を駆逐しつつある
例ってことでいいんじゃない?
loading buffer = ホッチキス
loading dye = ステイプラー
ってことで・・・

藻前らだってギルソン純正品じゃなくてもピペットマンって
呼ぶし,グライナーの微量遠心チューブのことも「エッペン」
と呼ぶだろ?小型簡易型卓上遠心機はどこのメーカーの品でも
「チビタン」でいいだろ?
#ところでうちでは15mlと50mlのコニカルチューブは両方とも
「ファルコン」って呼ぶんだが、それでいいのか?

309 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/12(金) 08:37:35
俺はいつも「あの青いの」って言ってる

310 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/12(金) 21:09:05
というわけで2chが閉鎖しそうです

311 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/15(月) 12:16:23
ageさせてください。
3.5kbのcDNAをクローニングしたくて、種々の都合上でN末1.7kbとC末2.0kbに分けて
サブクローニング。このN末とC末のフラグメントを連結したいが制限酵素サイトがない。
N末とC末の重なりしろは200bp。

教授は制限酵素使わず2つのフラグメントをプライマーなしでPCRかけると連結する
(重なり部分でrecombinationみたく)というが、やってみても上手くいかない。

質問はこのストラテジーは普通に出来るものなのか?と、
もし出来るなら気をつけるポイントを教えて欲しいです。

312 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/15(月) 12:27:17
もうちょっと工夫したPCRがあるよ
PCR fusionで検索しろ

313 :311:2007/01/15(月) 12:35:42
>>312
即レスありがとう。でももう少しヒントを。。。

314 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/15(月) 12:40:31
ヒント.google

315 :博多っ子:2007/01/15(月) 12:54:41
唐突ですみません。
亜鉛(ZnCl2)で阻害されるプロテアーゼってありますか?
どなたか教えてください。


316 :311:2007/01/15(月) 13:33:47
作業入ったから席空けてたけど、ぐぐったら線虫の遺伝子に
GFPをPCRでくっつけたpaperまで辿り着いたわ。今から読む。
thx!! >>312, >>314


317 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/15(月) 16:26:01
ちゃんと調べたみたいだから教えてあげると,
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/3001.html
ここの方法が一番簡単だよ

318 :311:2007/01/15(月) 20:31:14
やーありがとう。のりしろを挟んだ部分のPCRでバンド確認できた。
普通のPCRにテンプレート2つ入れるだけで良かったんだね。簡単すぎてビビった。
最初出なかった理由はサイクル数低かったのと、教授の指示したステップはむしろ
不要だったことかな。でも本当は全長取らなくちゃいけないので待ちぼうけです。
釣りバカ見たかったな…。

>>317
使えそうなサイト。さんきゅ☆

319 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/15(月) 22:52:20
もうやったのかよっ

320 :博多っ子:2007/01/16(火) 00:30:41
亜鉛(ZnCl2)で活性が阻害されるプロテアーゼって知ってますか?
どなたか教えてください。


321 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/16(火) 01:00:32
はぁ?聞こえんな

322 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/16(火) 02:32:54
>>321
うはっ!

323 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/16(火) 13:41:26
Znをキレート剤で奪うと活性が阻害されるプロテアーゼの間違いじゃなくて?

324 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 13:28:03
自分は卒研発表会を目前に控えた学部4年生です。

約1年間自分なりにがんばってきたんですが、この時期になっても卒研で出せるような
データが出ませんでした。ここ2ヶ月ぐらいはホント鼻血が噴出すぐらい必死でやった
んですが、ダメでした。で、そんな自分を見かねたのか、今日研究室のボスから今まで
自分がやってた実験を代わりにやってやる的なことを言われました。
ボスが代わりにやったからといって満足のいくデータが出るという保障はないのですが、
もし仮にデータが出たとすると、卒研発表会ではそのデータを使ったプレゼンをすることになります。
でも自分としては、他人に(ボスに)やってもらって出たデータを、さも自分がやりました
というような発表はしたくないのです。
こんな考え方は幼稚でしょうか?自己満足でしかないんでしょうか?

325 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 13:52:27
卒研なんて、研究の背景、問題点、手法、今後について
をきちんと話せれば八割できたもんだろ。
実際にやったことはうまく行ったりいかなかったりする。
ダメだったときはその原因を推測して、改良する方法を考えたり、
別の手法を使ったりする予定、としたらいい。

あ、さも自分がやったようにいうというのはダメね。
自分もやったけどうまく行かず、誰々がしたらこうなって、
ちがいはどこがどうで、と説明する。
実験やっている時よく横で見せてもらい。

326 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 14:00:02
>>324
俺も全然データでないよ。
お互いベストを尽くそう。
>>325
私も参考になりました。ありがとうございます。

327 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 15:05:22
卒研なんて、論文にならないようなどうでもよいデータでOKでしょ?
それすら出せないって、言葉悪いけど、あなたによっぽど問題があるんだと思うよ。(まあ研究にかなり向いてないってこと)

ボスがやってくれるっていってるんなら、やってもらえばよいと思う。
ボスも心配なんだよ。

328 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 16:19:22
まぁその可能性もあるが、そもそも達成不可能なテーマだったという可能性もある。
とはいえ、ボスがやったらあっさりできちゃった、というなら話は別だけど。

329 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 18:49:27
乳鉢ってオートクレーブ可能?
可能ならアルミに包んだ方が良い?

330 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 20:07:27
>>328
そこですわ
ボスがやったらあっさり

331 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 20:18:11
>>329

可能です
乾熱滅菌も大丈夫

332 :329:2007/01/18(木) 21:23:31
>>331
ありがとう。

333 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 22:28:03
>>330
おまw

334 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 23:04:25
嫌みいうつもりじゃないけど、ここで聞かなくてもわかるだろうに。
乳鉢がどうやって作られたか知っていたら。

335 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 23:08:44
>>334
乳鉢の作り方…。
や、やはり豊満な乳を持つ女子の胸で型を取ったりするのか…?(`・ω・´)ゴクリ

336 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 23:12:38
ボスがやったら
あっさりDNAとれた
ボスがやったら
あっさりPCR増えた
ボスがやったら
あっさりシーケンスできた
ボスがやったら
あっさりコネクトできた
ボスがやったら
あっさりコンセンサスの向きがそろった
ボスがやったら
あっさりアライメントできた
ボスがやったら
あっさりAMOVA解析できた
ボスがやったら
あっさり論文書けた


337 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/18(木) 23:28:12
ボスがやったら
あっさり有意差が出たw

338 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 00:49:22
ボスがやったら
あっさりネットワークが構築できた

339 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 01:35:22
ボスがやったら
欲しいバンドが思いのままに出るようになった。

340 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 01:40:51
ある抗体に対する抗原を組織から同定する場合

2D電気泳動×1枚→PVDF膜でウェスタン→メンブレンのスポットを切り出し

2D電気泳動×2枚→片方をウェスタンし片方を銀染色→ウェスタンに対応する位置をゲルから切り出し

という2つの方法が考えられますがどちらが楽でしょうか?

341 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 02:00:14
物取りなんていまどきやる奴の気が知れない
任期が切れるぞ

342 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 11:53:06
●キャシャーン造ろうぜ!人造人間キャシャーン。あと「ほしのあき」を
10万人!全国の風俗店に着払いで発送してください。

343 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 15:53:52
論文とかでウェスタンのところで
「1レーンあたり何マイクログラムのタンパクを
SDS-PAGEする」って書いてあるのですがどのように
調べてるのでしょうか。

344 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 16:07:53
普通に定量したんじゃないの?

345 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/19(金) 23:17:38
>>341
手を広げすぎたので、いまは物取り(ラボで)と公募書類書き(自宅で)しかやることがないんです。

346 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/20(土) 06:18:18
●2chやってるじゃん

347 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/20(土) 15:38:03
>>343
まさか、お前のラボには分**度*も置いてないのかっ!(敢えて伏字

348 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/20(土) 16:43:33
分度器のことかー!!











って冗談は置いといて、地方の貧乏ラボなら置いてない事もあるだろ
(うちの隣のラボとか。いっつも借りに来てUzee)

349 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/20(土) 16:47:40
ブラッドフォードのことを念頭に。
どうせBSAとかでスタンダードとるんだから、
一連のBSA希釈と一緒にサンプルとったら簡易測定は出来そうだな。

350 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/20(土) 17:25:35
>>348
そうなのか・・・だったら、うちの大学は恵まれているんだな・・・
ソレなんて、一人一台あるし・・・


もしかして、NMRが置いてないとか、X線解析機とか、スパコンとか全くない大学とかもあるんかな・・・

351 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/20(土) 22:57:27
大学レベルは知らんが研究室レベルでなら変でもない。

352 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 13:27:17
●分度器でほしのあき測ったけど?どの角度の事?俺の研究室じゃこれ以上
無理よ。

353 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 15:43:37
>>350
私大ならある方が珍しい
地国でもない場合はない

まあ、分子生物学において必要不可欠なものじゃないし

354 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 15:58:10
しかし一人一台はさすがに多いな

355 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 16:08:17
置く場所がねーよw
俺は地方の国立だけど、研究室ごとに1,2個だな。

356 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 16:11:34
NMRが1人1台?すげー

横浜?

357 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 16:20:04
NMRの話じゃねえだろw









分度器の話だろ、常識的に考えて。

358 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 16:40:05
NMRを一人一台か・・・

どれだけ大きな研究室なんだ

359 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 17:51:24
分度器が1人1個か…

どこの小学校だろう?

360 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 20:04:35
●もう駄目だぁ。俺には何処の角度かわかんねぇ...ほしのあき発送するね。
みんなで計ってね。実験失敗あるよ...NMRって何?

361 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/21(日) 22:31:13
ICD-10 F80.0

362 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/22(月) 16:00:51
普通のcDNAライブラリー作成って、
今の時代でもラムダZAPIIのGigapackGoldIIIがベストなの?
それからmRNA精製はOligotex?

363 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/22(月) 16:08:32
http://dblog.jp/RExCHAN/

364 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/22(月) 17:11:44
電気泳動の画像をPhotoshopで補正したいと思います。
レーンが乱れてる(スマイリング+ゲル全体のゆがみ)んですが、
どうやって補正すればいいでしょう?

365 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/22(月) 20:11:23
ゲル濾過で分子量の推定をしようと、以前書いた検量線に照らし合わせたら、
出るはずの位置と全く別の位置に出て困っています。
具体的には分子量4,000のタンパクが、分子量10,000前後に出ます。
ちなみに多量体にはなりそうもないタンパクです。

検量線を書いた条件との違いは、KCl濃度を2Mに変更した点くらいしか思いつきません。
先輩は塩濃度がゲル濾過の溶出に影響を与えるとは聞いたことがないそうです。
ただし、非常識な塩濃度なので、そういうこともあるのかなと。

塩濃度が非常に高いと、こういうことってありますか?

366 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/22(月) 20:33:47
溶液条件が同じ状態で検量線引かな…

367 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/23(火) 15:26:30
>>366
了解しました。
どうもありがとうございました。

368 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/25(木) 00:17:54
タンパクの染色について質問です
SDS-PAGEの後、一度全タンパク質を染色→脱色してそのゲルでウェスタンを行いたいのですが、この場合はどのような染色法が使えるのでしょうか?
予算や感度の問題などありますのでいくつか挙げてくれれば幸いです

369 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/25(木) 00:24:50
>>368
目的は?膜に移してからならポンソーSで染められるよ。普通にウエスタンに使える。
てか、スレ違いだろう?

370 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/25(木) 22:05:30
TAクローニングしたら同じ領域が欠失したプラスミドしか取れてこなかった。
やる気あるのか、大腸菌め!

371 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/26(金) 01:55:52
>>370
ヒント:ダイレクトシーケンス

372 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/26(金) 23:43:51
だいぶ前にこの前のスレで
誰かが金属製?のウォーターバスに繁殖してる茶色のミズカビの駆除法を質問していたと思います

自分も似たような問題があります
20リットル以上に上る水をいちいち取り替えてカビを除去するのは大変なので
メチレンブルー、トルエン1滴、十円玉とかいろいろ方法があった最後のほうに
ある薬剤を投入するのがよいというレスがあったみたいですが
それがなんなのか・・・dat落ちしてしまいgoogleでも検索できません

どなたかご存じの方お答え下さればありがたいです


373 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/26(金) 23:45:05
塩酸です

374 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 13:08:00
出来るのから試したら?

375 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 19:48:19
フェノール類の排水基準: 5mg/L(下水道法)、1mg/L(特定事業場)

トルエン1滴:50mg
ウォーターバスの水量:10L

このまま流したら排水基準オーバーだよ。

ttp://www.okayama-u.ac.jp/user/ace/haisui/system/haisuikijyun.htm

376 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 20:26:03
>>372 これかな?
>>903
WAK-chemie
MEdical GmbH
っていうドイツの会社の。
高いけど効果は抜群。

377 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 21:58:37
ハイター最強

378 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 22:56:34
確かに、トルエンは効くけど、環境には良くないね。

次亜塩素酸の方がマシかもね。

379 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 23:01:32
そもそもなぜカビを除去しなければいけないのか
観葉植物の一緒と思って共存すればよいのでは?

380 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 23:10:56
ぬがー、4年目にして初めてRNA分解された
帰りに変なおっさんにいちゃもんつけられるしホント今日はついてない日だ

381 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 23:18:15
培養室のインキュベーターのカビはちょっと気持ち悪いぞ。

コンタミした事はないが・・・・。

382 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/27(土) 23:35:43
うちの研究室なんか廃液ビーカーやシンクの壁とかでカビが大繁殖

細胞つかってないからコンタミしてるかどうか分からんが喘息持ちには辛いぜ

383 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 00:00:47
廃液はビーカーよりメディウムびんとかの方が良いと思う。


384 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 13:11:02
>>382
カビが生えるなんて生易しい廃液だね。

385 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 13:59:56
そのカビで、有害な物質を浄化する特許が取れるかもしれない。土方からのわらしべ長者は
近い!

386 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 14:15:21
後のナウシカである。

387 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 14:29:40
うちの研究室の廃液はこんな感じかな。
全部混ぜてるみたい。

アジ化ナトリウム
クロロホルム
フェノール
メタノール
ドデシル硫酸ナトリウム
ホルムアルデヒド
メルカプトエタノール
グアニジンチオシアネート
エチジウムブロマイド
アンピシリン
テトラサイクリン
クロラムフェニコール
シクロヘキシミド
ペニシリン
リファンピシン


388 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 15:33:20
抗生物質って廃液として処理しないと駄目なの?

389 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 16:21:14
法的にはどうだか知らないが耐性菌を無用に増やさないためのマナー

390 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/28(日) 16:44:29
>>389
やっぱそうなのか。
俺は研究室に入りたてのころそんなことを思っていたが、すっかりそんな純粋な気持ちを忘れ去ってしまったorz

391 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/29(月) 20:38:41
>>390
取り敢えず、全部オートクレーブ掛けてみれば?

392 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/29(月) 22:21:46
カナマイシンとかちゃんと失活するかな。あれ大目に入れればオートクレーブ可ってきいたことある。

393 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 00:15:16
大腸菌のタンパク発現で封入体を調製してるんですが

破砕→界面活性剤で不要タンパクを可溶化→超遠→ペレット(封入体)回収

という流れで、最後のペレット回収でペレットが超遠心管にへばりついて取れません

ボルテックスでは全く無力で、超音波かけたら取れるかもしれませんが超遠心管に超音波をかけるのは気が引けてしまいやっていません
結局いつもはスパチュラで掻き取って回収してるのですがそれだと面倒くさいしスパチュラにへばりついてロスする分もあるしであまりいい方法とは思えません

皆さんはどのような方法で回収しているのでしょうか、ご教授お願いします

394 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 00:18:22
ホモジェナイザーなる道具を使ってる。
というか封入体なら超遠心でなくても1万Gあれば十分沈殿にいくと思うけれど。
そっちならボルテックスとかで十分懸濁出来るはず。

395 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 00:28:04
超音波で遠心管にたいしてそこまでダメージないだろ

396 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 00:52:33
すばやい回答どうもです

>>394
プロトコル本に2万5千Gとあったのでずっとそれでやってました
とりあえず何Gぐらいで落ちるか調べてみたいと思います

>>395
超音波かけても大丈夫と思いますが万が一が怖いのでちょっと遠慮します

397 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 20:08:11
96wellで細胞を培養したいと思っています。
培養中に無菌的にwashをするステップが何度かあるのですが、
おすすめの容器やマニホールドなどはありませんか?
また、上記は接着細胞で考えているのですが、浮遊細胞でも
同じようなことをしたい場合、どういった容器が使えるでしょう?

398 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 21:14:56
>>396
超遠心のときかかる力と超音波でかかる力と、どっちが大きいと思ってる?

399 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/30(火) 22:12:49
力の質が違う
不安がっているならやらなくて正解です
失敗しても責任取ってくれませんからね
ここの書き込み者は

400 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/31(水) 00:00:24
超音波かけないで解決するならそれでいいだろうに

401 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/31(水) 09:37:08
バッファー入れて氷上で半日放置すれば柔らかくなるよ。

402 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/31(水) 09:45:56
>>399
失敗しねーよ
6年間超音波で破砕してるが、一度も遠心管が砕け散ったこと
なんてない。
10年続けりゃ砕ける日も来るかもしれないが。

403 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/31(水) 10:15:27
気を取り直して次の話題へ


404 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/31(水) 13:31:39
あのー、>>397は…

405 :名無しゲノムのクローンさん:2007/01/31(水) 23:18:24
気を取り直して次の話題へ


406 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/01(木) 16:52:21
■ おすすめ2ちゃんねる 開発中。。。 by FOX ★
このスレを見ている人はこんなスレも見ています。(ver 0.20)
北海道大学・工学系 4時限目 [理系全般]
一緒に行く友達がいない人同士で食べ放題に行くオフ [定期OFF]


友達がいない人正直に名乗り出なさいw

407 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/01(木) 23:08:31
実験大好き私

408 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 04:16:34
ところで皆さん、細胞を遠心するときってどれくらいの速度でまわしてます?
普通の遠心機だとGの表示は無いので回転数で決めますよね?



409 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 10:50:08
>>408
計算するんだよ。

一度、1500 rpmくらいで回してみ?
保証はせんけど、そんなもんでとりあえず、挑戦。

410 :408:2007/02/07(水) 11:42:27
どうも。
実験を始めて15年ほどになりますが、その間ずっと1500〜1800で回してきました。
もちろんHeLaなどのごく普通の丈夫系な細胞の場合です。
他の細胞の場合は「細胞による」、例えばES細胞だと1000に落としたり。

ところが最近来たラボの人に「哺乳類の細胞は1000で回すのが常識なんだよプ」
なんていわれたのでちょっとムカつくというか驚くというか。
「細胞によるんだよ。」って言っても聞く耳持たず。
ひょっとしたら俺が知らなかっただけなのか?とも考えて質問したということです。



411 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 14:55:00
ま、細胞が元気のまま回収できればいいんだし、喧嘩しないで・・・。

412 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 21:35:39
遠心機のローター半径と、細胞の平均密度と、細胞懸濁液の粘性係数が必要


413 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 22:02:58
面白いやつだな、ロータの半径とか無関係に1000rpmでまわす意味を聞いてみたら?

414 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 22:21:43
何のために論文やプロトコル集で
(数字)×g
って表記してるのか分かってるんだろうか、ソイツ・・・

415 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 23:32:05
ところで、この×ってどう入力してる?

416 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/07(水) 23:40:50
「さ」のところのxだな。小文字で。てか、それ以外にあるかな?全角文字とか御法度だよ。

417 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/08(木) 00:29:50
ワードだとさ
プルダウンメニューから
挿入→記号と特殊文字ってあるだろ

418 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/08(木) 00:34:03
>>413
いちいち考えるのが面倒だから、培養室においてある同じような
大きさの遠心機で細胞を落とすときは1000rpmでいい。


419 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/08(木) 00:40:13
いちいち考えなくても、一度考えれば十分だよw

420 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/08(木) 01:34:10
それを言うなら一度やってみて大丈夫ならそれでいいということになる。


421 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/09(金) 01:04:54
ちょっと聞きたいのだけれど
サンプルを免疫沈降後に凍結保存ってできる?

422 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/09(金) 01:26:39
>>421
ものによりけり

423 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/09(金) 04:10:42
>>421
何に使うかも大きいね。
ただ単にウェスタンしたいだけならSDSローディングバッファー放り込んでおくと長い間安定だよ。


424 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/09(金) 14:15:34
デュアルルシフェラーゼアッセイで、レポーターアッセイに使うホタルルシフェラーゼと
レファレンスとしてのウミシイタケルシフェラーゼ(phRL-TK)を用いています。
MAPK経路でレポーターが発現する系なんですが、EGFで刺激すると、レファレンスの
ウミシイタケルシフェラーゼの発現も増加してしまい、RLUが思ったよりかせげません。
よいアイデアはありませんか?

425 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/11(日) 00:41:06
実験でうまくいかないというわけではありませんが、ぜひ皆様の知恵をお貸し下さい

いま二次元ウェスタンを行っているのですが、泳動してブロッティングする前に泳動状況を確認するためタンパク質の染色を行いたいと思うことがしばしばあります
ブロッティング後にCBB染色という手は予算の都合上ニトロセルロース膜しか使えないので出来ず、同じく高いキットも買えません
同じサンプルを2つ流すという手もあるのですがこれも予算の都合に加えサンプルが貴重なのでこれも出来ません
染色は出来ればCBB以上の感度が欲しいですがブロッティング効率を優先したいところです

注文が多くて難しいと思いますが貧乏研究室の学生に愛の手を差し伸べてください

426 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/11(日) 00:47:03
>>425
感度はそれほど高くないけど、ポンソーSは駄目?
CBBに少し劣るくらいだけど。

427 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/11(日) 00:47:52
感度は低いがポンソーで染めるのは良くやるよね。

428 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/11(日) 00:48:27
あ、カブったw

429 :425:2007/02/11(日) 01:02:14
>>426-427
回答ありがとうございます
ポンソーは試した事がないですが、元々流してるタンパク量が少ないのでCBB以下の感度ではキツイです
正直CBBでもメジャーなスポットがポツンポツンと見える程度であまり良くないです

430 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/11(日) 01:25:57
1/4くらいを別に流すとか。

431 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/11(日) 13:40:56
pvdfってそんなに高いの?

432 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/12(月) 22:01:38
培養液のO.D.値の測定について質問です。
論文やプロトコール本等に通常書かれているO.D.値は、
光路長10mmキュベットを用いて測定された値なのでしょうか?
Φ18mm試験管等の異なる光路長で測定した値は、
やはり異なるのでしょうか?

433 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/12(月) 22:11:36
>>432
実験の原理も知らん馬鹿学生はさっさと学校やめて就職しろ

434 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/12(月) 23:02:04
>>433
おまえ、自分の人生が終わってるからって、未来ある若者を
不幸に引きずり込むなや。

435 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/12(月) 23:05:12
何か良く読むと釣りにも見えるが...

疑問に思ったら、実験、実験。

436 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/12(月) 23:29:13
>>433
吸光度は光路長と濃度に比例するんで、変わってしまいますよね?
論文等に書かれている値は10mmと取っていいのでしょうか?

>>434
すでに明るい未来は無いので大丈夫です!

>>434
確かに実験した方が早いですね。
ただ、同じ光路長でも違う機械で測定すると、結構違ったり…
これは機器の個体差なのか、ぶっ壊れてるのか…
少なくとも機器の保守はひどい状況です。

437 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/12(月) 23:33:59
細胞やコロイドのような散乱が入ると、受光部とセルの距離、フォトマルの構成で見かけの吸光度は変わる。
測定する物質が均質な溶液で純粋に特定波長の吸収のみで、散乱がないなら、
機械を変えても吸光度同じ建前。

438 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 00:12:55
>>436
慣習的に光路長10mmの値で表すことになっている。
それから、細かいことを言えばO.D.≠吸光度。
>>437さんが書いてるように、O.D.は散乱等を含み得る値。

439 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 01:13:13
>>437-438
ありがとうございます。やっぱり10mmだったんですね。
研究室に入ってから、何も考えずにΦ18mm試験管でばかり測ってたんですが、
どおりで論文等に出てくる菌数よりも少ないわけですね。
今度から10mmで測っていこうと思います。
しかし、うちの研究室はボスも含めて駄目だ…
誰もそんなこと気にしないし、ボスはΦ18mm試験管でO.D.と菌数測って、
やけに少ないなーなんて言ってるし…

440 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 01:58:32
18mmの試験管で検量線引いたのなら、18mmの試験管の値を使ったら?


441 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 02:06:43
その機械は1cmの値に換算しないの?

442 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 02:36:01
>>440
18mm試験管のO.D.値に対する10mmのO.D.を測定しておいて、
場合によって10mm値、18mm→10mm変換値を使い分けます。

>>441
換算しないです。超アナログですし・・・
この間換えランプを注文したら2個で1マソ以上・・・

ところで、皆さんは10mmキュベットに移した菌液は、
そのまま捨ててしまうのでしょうか?
もったいない気もしますが、無菌にするのも難しそうですし。

443 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 16:56:22
>>439
>誰もそんなこと気にしないし、ボスはΦ18mm試験管でO.D.と菌数測って、
>やけに少ないなーなんて言ってるし…

18mmで測ったら「やけに多いなー」にならないか?

444 : あだち:2007/02/13(火) 17:15:41
 「勝手メール」失礼します。

   ■□■□■□■□■  「疲れに勝つ!」  ■□■□■□■□■          

     肉体の疲れは「時」が解決してくれます。 よくたべてよく眠ることです。
    しかし、魂の疲労はその効果をだし得ません。
 
           魂の元気回復はただ単純法則に従うこと!

      人を元気づける者は、自分も元気をもらえる、という法則です。

     この法則に従うと「あなたは新たなる力を得、ワシのように翼をはっての
    ぼることができる。走っても疲れることなく、歩いても弱ることはない」
 
     人のからだには、生体リズムというものがあります。生きる喜びをもつ者
    には、生きる力が与えられ、全てを悪く考える人には、悪いリズムが連な
    っていきます。

     さて、生体リズムをどうとり入れるかです。きつい時に人に手を差しのば
    すと、走っても疲れる事はありません。やってみる事です。

    ============================

                      安達三郎

あなたも「新約聖書」ローマ人への手紙・7章 をどうぞ、生きる「力」が与えられます。   



445 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 19:47:44
>>424
(・∀・)人(・∀・)

私も同じことで詰まりました。Firefly、Renillaがそろってactivate
あるいはsuppressされて、ratioをとると…orz
internalのベクターにp(h)RL-nullを試してみましたか?私の時はそれで少しは
マシになった記憶があります。ただやっぱり多少はRenillaの方も影響を受けるので
あくまでもTKとかSV40よりマシ、という程度ですが。。。
やはりベクターのバックボーンに転写因子が結合して、ある程度影響が出るんだろうか
(だからnullでも光るんだろうけど)、と漫然と考えてましたが。

くわしい人アイディアplz

446 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 23:23:12
竹石圭佑…中国で生まれ名古屋で育つ20歳。小学生を狙う強姦魔

447 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/13(火) 23:51:40
>>443
O.D.に対して菌数が少ないと言う意味です。
O.D.が同じなら光路長の長い18mmの方がより薄いはずです。

448 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 00:05:32
なんていうか、
A=ωcLという公式ひとつ覚えていれば、こんなめんどうにはならなかったのにな。

449 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 02:20:21
コレットメーターの試験管は直径が18mmというだけで
光路長がすべての光路にわたって一定なわけではないのだ。
そんな簡単にはいかんよ。

450 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 02:23:35
なるほど。勉強になる。

451 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 03:09:41
>>445
これって同じDNAを導入してるんだから、割らなくてもいいってことには
ならないのかな。そんなに導入効率ぶれないんじゃない?

452 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 05:52:49
便乗ですが
コンピテントセルを作るとき
OD600計れと言われて
0.4で止めて集菌して作ったんですが
ブランクに水を使ってたことに気がつきました
SOBをブランクにして計り直したら
ー0.1ぐらいに出たんですが
作っちゃったコンピは使えますか?
ていうかODがマイナスってありですか?

453 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 07:11:19
>>452
実際に菌を培養した培地と、ブランクに使った培地が違うとしか
考えられない。(培養中に多少は培地自体のODが変化するとは
思いますが。)

菌があったのなら、コンピテンシーは低くなるけれど、使えなくは
ないのでは。培養開始時のODを決めたら、後は時間で決めても
いいと書こうと思ったけど、最初のODも測れそうにないなあ・・・。


454 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 09:33:46
>>452
ここで聞くより、定量したプラスミドをTFして一晩待った方が早いと思うw


455 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/14(水) 10:26:16
O.D.の0.1ぐらいは培養時間を30分ずらしただけで平気で変わるから、問題ない

456 :「!wrestler」:2007/02/14(水) 15:44:01
なはたゃたま。


457 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/21(水) 17:51:35
ラボの大掃除をしていたら、大昔のデシケータが出てきました。
中身はもうどうでもいいので捨てようと思ったんですが、蓋がびくともしません。
どうやって開ければいいでしょう。。。

458 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/21(水) 21:00:11
お湯に浸す、しばらく置く

459 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 06:37:56
屋上から投げ落とす

460 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 09:27:01
あて切り

461 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 11:52:03
みね打ち

462 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 13:36:50
SOSUI以外で膜貫通領域わかるサイトってどこかありませんか?
先日コンストラクションでSOSUI使って貫通領域調べて、そこを削って
プラスミド作ったんですけど、目的のタンパクが何故か分泌されないんです。


463 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 14:51:12
TMHMMてのがある
ttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ とか
ttp://www.pdc.kth.se/~hakanv/prodiv-tmhmm/ とか
上は今落ちてるぽいが

てか膜貫通領域を切除して分泌されるというのは普通の現象なのか?
そもそもタンパク質の発現は確認しているの?

464 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 17:18:48
プレセニリン?

465 :462:2007/02/22(木) 18:25:33
>>463
dクス。早速使わせていただきます。
シグナル配列あるのでおそらく分泌されるかとは思うのですが。
SOSUIでサーチした膜内領域以下を削ったものを作ったのですが、
supとcell lysateの両方WBしたら、lysateサンプルだけにバンドが。
そこでシグナル配列を別のものに入れ替えてみても結局lysate
サンプルにしかバンドなす。
仕方ないからそこから3AAずつ、最大9AAまで削ってもsupには目的の
タンパクが発現せず。
といった状況なのです。。

466 :名無しゲノムのクローンさん:2007/02/22(木) 20:54:00
廃牛乳を使ってメタン発酵をしているのですが
水素と二酸化炭素は出来ているのですがメタンがなかなか出来ない
です。


116 KB
■ このスレッドは過去ログ倉庫に格納されています

★スマホ版★ 掲示板に戻る 全部 前100 次100 最新50

read.cgi ver 05.02.02 2014/06/23 Mango Mangüé ★
FOX ★ DSO(Dynamic Shared Object)