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【そろそろ】qPCR【いまさら】

1 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 00:46:36
絶対必要かって言われると、すみません「ならでは」の成果は出せていません。
皆さんqPCR導入しました?導入してよかったこと、面倒なことこぼしませんか。

2 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 00:54:36
qPCRを使うといやでも数字が出るから、なんかいか実験しないといかんね。
あと、バンドでフィギュアを作る方が楽、写真の取り方であるようにもないようにも見えるから。
ぶっちゃけ捏造も簡単だよね。
同じPCR産物を量を変えてウェルに流すだけで終了。

3 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 00:57:20
いまさら、なので議論不要。

4 :sage:2005/10/30(日) 01:09:27
ノー算よりラクでいいが,ナニ引っ掛けているかわからんことある。

5 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 01:14:15
>4
そういうときは産物サイズをチェック。


6 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 01:14:59
>>3
お前の発言から察するに製薬かかずさかそれとも宮廷上位の医学部さんですね。
生物でそんな口利ける人間は特定できるけどお前じゃないんだよね。

7 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 01:16:38
LightCycler派集まれる?

8 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 01:17:12
>>6
??ど、どうしたんだ6よ?

9 ::2005/10/30(日) 01:18:06
使ってたよ。
あの音とデザインがすき。

10 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 13:55:40
キャピラリーの単価をもっと安くしてくれ。

11 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 18:19:32
1は逃亡か?
ねた提供しやがれ。

12 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 18:25:49
1kbのqPCRって、LightCyclerでうまくやる方法ありませんか?

13 :名無しゲノムのクローンさん:2005/10/30(日) 20:55:33
なぜ1KBなのだ?
もっと小さくデザインできないの?

14 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 02:05:45
ttp://www.mastercycler.com/
これって普通のPCRプレートでqPCRできるのかね?

15 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 02:13:35
>>12
だからABIにしておけとあれほど

16 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 02:56:10
テンプレート・プライマー・PCR条件が
全て完璧でない限りは信用できない
(特にサイバーグリーンとかの簡易系)。
論文投稿の際もレビュワーからQPCRの
信頼性についてのクレームが付くことも多い。

17 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 03:24:55
でも折れ的には微妙な差でない限り、
結構正確なんだが。
少なくともノザンじゃ怪しい時がある。
クレームがつくのはしっとるが。

18 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 03:26:48
確かにノザンの場合微妙な差は解析できんわな。


19 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 09:16:31
ノザンで見えないような微妙な差をqPCRで出すって・・・

20 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 09:30:37
>>19 ノザンで見えないような微妙な差

ほとんどアーティファクトの世界ですな・・・
qPCRで2倍とかの差は全然信用できない(RNAの濃度測定や
ピペッティング操作一つでいくらでも変わりうる範囲)。

ノザンが不可能なほど発現量が低いときはRNase
プロテクションが一番信頼できる。

qPCRのキット売ってる会社が儲けてるだけだと思います。

21 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 11:43:38
マジレスするとqPCRの有利なとこは
大量のサンプル(6グループ X N=6 とか)を平行して解析して
統計的に有為か出せるとこ。
2倍とかの差に意味を持たせることができる。

>>20
qPCRで2倍の差は全然信用できない、てのは
あなたは昔の人なんでしょうね。
まあ見てるものによっては2倍の差は意味ないと思うけど
それを一般化しちゃだめでしょう。

22 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 12:12:10
経験的にいうと、サイバーグリーンで2倍の差を有為に出すためには、
10個くらいサンプルを取らないと難しいね。
オレは2倍程度の差しかないものにqPCRは使わない。


23 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 13:28:57
>>22
再現性と生物学的意義があれば
2倍の差でもオケだと思われ。

24 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/01(火) 22:38:12
>>23
>>22が言ってるのは、2倍の差に意味がないってことではなくって、
2倍程度の差だとqPCRでは差があることを示すのが大変だってことなのでは?

25 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 06:48:12
>>24
もしそうだとしたら、qPCRのqはなんのq?
qualitative? questionable?

26 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 07:53:58
お前ら実験下手だな。
俺何度やっても2倍でるぞ。
濃度測定の誤差とか言ってるけどおまいらコントロール置かないのか?


27 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 08:02:29
>>20, 22は実験の下手な院生か
狂ったピペットを使ってるDQNポスドク。

28 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 12:23:45
>>26
マジで?
ChIPとかやっても2倍はぶれるよ、軽ーく。
多分20サイクル以内で立ち上がる、めっさ濃いサンプルしか使ってないんじゃないかと。

29 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 12:35:01
>>26
それはqPCRじゃなくてChIPの問題だと思われ

30 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 12:54:33
同じサンプルをPCRしてもぶれるのDEATH

31 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 13:13:12
>>30
その実験ダメだな。
逝ってよし!

32 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 20:53:30
20サイクル以降でも問題ないっす。
さすがに32サイクルとかで立ち上がるのは微妙な場合があるが。
お前ら実験下手すぎ。
ただ差が出たら別のプライマーでも試すことは重要だな。
差が異なることがある。といってもそこまではないが。

33 :32:2005/11/02(水) 20:56:19
20はRNAの濃度とか言っとるが、
ある程度濃度をあわせて置けば、コントロールで割れば同じになる。
そんなことも知らんのか?
元のRNAの濃度あわせたところで、
逆転写効率も考慮しないといけないわけで、
大体一定にしておけば問題ないっす。

34 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/02(水) 22:19:39
Taqmanどこの会社がいい?
appliedのMGBはどうっすか?

35 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/06(日) 22:59:46
全く同一のサンプルでも最初のテンプレートにどのくらい使うか
とかで全然結果が違ったりする。

36 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/07(月) 16:59:33
iCycler使ってますが、やっぱりPCR efficiencyは100%に近くないと
だめなのでしょうか?
いつも70%で安定している、というのでもだめなのですか?

37 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/08(火) 08:32:42
まとめ・考察!!

みんな実験下手すぎ!

38 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/09(水) 06:40:31
超精製した綺麗なサンプル使って数個の比較実験するなら再現性
あるけど組織から抽出したようなトータルRNAのサンプルで
96 well目一杯使って微妙な実験の差を出そうとすれば・・・

39 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/09(水) 10:23:20
>>38
それもqPCRじゃなくてそれ以前の問題。

サンプルが汚いんだったら、精製しろ!
サンプル間のばらつきが大きすぎるんだったら
サンプル数増やせ!
それでダメなら系を変える!

ちなみに俺は384穴だけどね。



40 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/09(水) 15:44:06
>>39
統計馬鹿の陥りやすいパターンだ。
クリティカルな差なら通常のPCR一発で結果が出る。

精製や測定の日時が異なる数十サンプルの核酸を全く同じ純度で
準備できる奴なんてどれほど居るんだろう?
さらに”サンプルが汚い”という場合核酸の純度の問題でない場合も多い。
経時変化取るとか言って同じマウスから一時間おきに延々採血続けてる
馬鹿を見たときは唖然としたよ(最初と最後で血球組成が違ってるに決
まってるし、マウスにストレス性の刺激がかかってるはず。何の影響
見てるんだか分かったもんじゃない)。

ともかくqPCRは勤勉バカにはおあつらえ向きの作業(ロボットの一部と
化してくれるからね)であることは認めるよ。

41 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/10(木) 04:28:40
>> 39

>クリティカルな差なら通常のPCR一発で結果が出る。

「通常のPCR」ってなんですか?あなた、バカですか?

> 精製や測定の日時が異なる数十サンプルの核酸を全く同じ純度で
準備できる奴なんてどれほど居るんだろう?

もしそうなら、実験プランが悪いのでは?
それとも実験センスがないのですか?
それに、なんのためのインターナルコントロールですか?

> ともかくqPCRは勤勉バカにはおあつらえ向きの作業(ロボットの一部と
化してくれるからね)であることは認めるよ。

それをいったら生物の実験ってほとんどが作業ですが。
実験してる時点で使われる身だってことでしょ?
(例:教授は実験しない)

てか、DQN学生に何いっても無駄かな?

42 :名無しゲノムのクローンさん:2005/11/10(木) 21:39:02
教授も実験してるよ。

言い訳して隠居してるのは、無能なのを隠してるだけだから。

43 :名無しゲノムのクローンさん:2006/02/14(火) 12:15:00
iCyclerかABI7500かstratageneのmx3005で迷ってます
使ってる方、使用感など教えていただけませんか?

44 :名無しゲノムのクローンさん:2006/06/26(月) 19:50:10
Real-time PCRの試薬節約しろと命令がでて困ってます。どなたか節約法知っている人いませんか?
希釈バッファーとか販売されていたら教えてください。
QiagenのQuantitect SYBR Green RT-PCRを使っています。スケールを半分にしたらだめですかね・・・
>>43
うちではiCycler使ってますが、結果は安定してでますよ。使い勝手も悪くないです。他のと比べたことありませんがorz

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